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申请/专利权人：综合医院公司

摘要：本文中描述的技术涉及经修饰的T细胞和它们在免疫治疗性方法中的用途。在各种实施例中,修饰T细胞,从而降低或消除CD3ζ,TRAC,和或TRBC表达。

主权项：1.一种分离的T淋巴细胞,其由于消除的CD3ζ基因的表达,经过修饰而具有消除的T细胞受体TCR的表达，且经过修饰而包含编码抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP的病毒蛋白的基因，其中该病毒蛋白选自由单纯疱疹病毒HSVICP47和埃巴二氏病毒EBVBLNF2a组成的组。

全文数据：经修饰的T细胞和它们的使用方法技术领域本文中描述的技术涉及经修饰的T细胞和它们在免疫治疗性方法中的用途。发明背景过继性T细胞疗法牵涉施用抗原特异性T细胞来治疗疾病,包括癌症,传染病,和自身免疫性疾病。这种疗法中使用的T细胞可以自受试者分离并选择期望的,预先存在的特异性。作为一个例子,肿瘤浸润性T淋巴细胞可以自受试者分离,离体扩充,然后施用以治疗受试者中的癌症。在其它办法中,T细胞可以经过离体修饰而具有新的特异性。在此类办法的一个例子中,T细胞经过离体遗传修饰而表达嵌合抗原受体CAR。CAR提供一种将细胞毒性T细胞应答导向表达选定靶抗原最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的靶细胞的方式。CAR是T细胞受体的一种改编,其中用特异性结合靶抗原的抗体的抗原结合域替换抗原结合域。在T细胞“CART细胞”或“CAR-T”上表达的CAR对靶细胞的表面上的靶抗原的啮合促进对靶细胞的杀伤。在另一个例子中,T细胞经过离体遗传修饰而表达新的T细胞受体。当前用于过继性T细胞疗法的办法一般采用自体细胞,即自稍后要对其施用的受试者获得的细胞。这种办法就最小化接受者排斥施用的细胞的可能性而言可能是有益的。然而,这种办法的缺点包括需要专门化的人员和设施,以及与自可能病得很重的患者获得细胞,然后需要让患者等待细胞加工有关的复杂性。鉴于这些挑战,会想要在过继性T细胞疗法中使用自与接受者相同物种的,遗传上不同的供体获得的同种异体细胞。这会允许生成,储存,和验证“通用”T细胞,供需要时使用。然而,这种办法呈现它自己的挑战,由于接受者针对捐献的细胞的免疫反应,这可能导致包括细胞持久性低,有免疫能力的受试者中的宿主抗移植物效应,和免疫受损的受试者中的移植物抗宿主效应在内的问题。需要新的办法来克服现有的用于过继性T细胞疗法的方法带来的挑战,诸如上文记录的那些。发明概述在一个方面,本发明提供分离的T淋巴细胞,其由于例如降低的或消除的CD3ζ,T细胞受体α链TRAC,和或T细胞受体β链TRBC基因的表达,经过修饰而具有降低的或消除的T细胞受体TCR的表达。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞包括其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因,调节序列,编码序列,外显子,或其一部分突变例如包括删除,诸如移码突变,导致降低的,缺无的,或非功能性的CD3ζzeta,泽塔,CD3ηeta,伊塔,CD3θtheta,西塔,TRAC,和或TRBC表达的基因组。在一个实施方案中,该突变破坏T细胞受体的装配或CD3ζ信号传导。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞具有其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因删除的基因组。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞具有其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的两个等位基因删除的基因组。在一个实施方案中,该降低的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的表达是缺无的表达。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步具有降低的CD3η或CD3θ的表达。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步具有一个HLA基因座例如染色体6上的HLA基因座,例如在人中或其一部分的删除或突变。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步具有降低的HLAI类表达。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞经过进一步修饰而表达HLA-G。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步包括编码推动T淋巴细胞规避来自对其施用该T淋巴细胞的宿主的免疫攻击例如T细胞或NK介导的排斥的异源蛋白的基因。在一个实施方案中,该异源蛋白是来自例如选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒的病毒蛋白。在一个实施方案中,该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。在一个实施方案中,该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP且任选选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步包括编码报告基因的基因,例如包括截短的表皮生长因子受体EGFR基因,截短的前列腺特异性膜抗原PSMA,截短的低亲和力神经生长因子受体LNGFR,截短的CD19的报告基因。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步包括编码治疗性蛋白例如抗原受体,其任选赋予对选定靶抗原或配体的特异性的基因。在一个实施方案中,该抗原受体是嵌合抗原受体CAR,其任选包括胞外域,跨膜区结构域,和胞内区结构域。在一个实施方案中,该胞外域包括单链抗体且任选该胞内域包含T细胞活化域。在一个实施方案中,该分离的T淋巴细胞进一步包括诱导细胞死亡的基因,例如是可活化的自杀基因例如由药物活化的自杀基因的基因。在一个实施方案中,该自杀基因表达与胱天蛋白酶9促凋亡分子融合的FK506结合域。在另一个方面,本发明提供用于生成经修饰的T淋巴细胞例如缺乏或具有降低的功能性TCR的表达的T淋巴细胞的方法,该方法包括灭活T淋巴细胞中的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因。在一个实施方案中,该灭活CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因是使用选自锌指核酸酶ZFN,转录活化物样效应器核酸酶TALEN,和聚簇规则间隔短回文重复CRISPRcas9系统的组的核酸酶或系统进行。在一个实施方案中,该经修饰的T淋巴细胞是如上文列出的任何实施方案中描述的经修饰的T淋巴细胞。在另一个方面,本发明提供针对疾病治疗受试者的方法,该方法包括对该受试者施用上文列出的任何一个或多个实施方案的分离的T淋巴细胞。在一个实施方案中,该疾病选自由癌症,传染病,和移植规程导致的适应症组成的组。在另一个方面,本发明提供降低受试者中的免疫原性反应的方法,该方法包括对受试者施用依照上文列出的任何一个或多个实施方案的T淋巴细胞。在一个实施方案中,该T淋巴细胞表达转基因。在一个实施方案中,该T淋巴细胞具有降低的与内源T细胞受体信号传导分子的竞争。在一个实施方案中,该T淋巴细胞就该受试者而言是自体的。在一个实施方案中,该T淋巴细胞就该受试者而言是同种异体的。在一个实施方案中,该经修饰的T淋巴细胞在体内扩充。在一个实施方案中,该经修饰的T淋巴细胞在该受试者的血液中扩充。在一个实施方案中,该经修饰的T淋巴细胞在施用前,在体外扩充。在另一个方面,本发明提供载体,其包括编码治疗性蛋白和推动免疫系统规避的异源蛋白的基因。在一个方面,该异源蛋白是来自例如选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒的病毒蛋白。在一个实施方案中,该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。在一个实施方案中,该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP且例如选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。在一个实施方案中,该治疗性蛋白是CAR。在另一个方面,本发明提供用上文列出的一个或多个实施方案的一种或多种载体转导T淋巴细胞的方法。在另一个方面,本发明提供依照上文列出的任何一个实施方案的方法生成的经修饰的T淋巴细胞或细胞系,或其传代培养物。在另一个方面,本发明提供药学组合物,其包括上文列出的任何一个或多个实施方案的至少一种经修饰的T淋巴细胞。在另一个方面,本发明提供治疗受试者的方法,其包括下述步骤:a依照上文列出的任何一个或多个实施方案的方法制备经修饰的T淋巴细胞的群体,和b将该经修饰的T淋巴细胞施用于该受试者。在一个实施方案中,该T淋巴细胞源自要治疗的受试者。在一个实施方案中,该T淋巴细胞源自健康供体。本发明还包括本文中描述的经修饰的T淋巴细胞在方法包括例如本文中描述的方法,例如治疗性方法中的用途,以及该经修饰的T淋巴细胞用于制备供例如本文中描述的方法中使用的药物的用途。如本领域技术人员确定为适宜的,上文列出的各个实施方案可以以任何组合彼此组合。定义为了便利,下文提供说明书,实施例,和所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明,或上下文暗示,下面的术语和短语包括下文提供的含义。提供定义来帮助描述特定实施方案,并非意图限制请求保护的技术,因为该技术的范围仅仅由权利要求限制。除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与此技术所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。如果术语在本领域中的用法和它在本文中提供的定义之间有明显差异的话,应当以说明书内提供的定义为准。免疫学和分子生物学中的常用术语的定义可以见TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,19thEdition,MerckSharp&DohmeCorp.,2011ISBN978-0-911910-19-3；RobertS.Porteretal.eds.,TheEncyclopediaofMolecularCellBiologyandMolecularMedicine,BlackwellScienceLtd.,1999-2012ISBN9783527600908；RobertA.Meyersed.,MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.,1995ISBN1-56081-569-8；ImmunologybyWernerLuttmann,Elsevier,2006；Janeway’sImmunobiology,KennethMurphy,AllanMowat,CaseyWeavereds.,Taylor&FrancisLimited,2014ISBN0815345305,9780815345305；Lewin'sGenesXI,Jones&BartlettPublishers,2014ISBN-1449659055；MichaelRichardGreenandJosephSambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,4thed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,USA2012ISBN1936113414；Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology,ElsevierSciencePublishing,Inc.,NewYork,USA2012ISBN044460149X；LaboratoryMethodsinEnzymology:DNA,JonLorsched.Elsevier,2013ISBN0124199542；CurrentProtocolsinMolecularBiologyCPMB,FrederickM.Ausubeled.,JohnWileyandSons,2014ISBN047150338X,9780471503385,CurrentProtocolsinProteinScienceCPPS,JohnE.Coliganed.,JohnWileyandSons,Inc.,2005；和CurrentProtocolsinImmunologyCPI,JohnE.Coligan,ADAMKruisbeek,DavidHMargulies,EthanMShevach,WarrenStrobeeds.,JohnWileyandSons,Inc.,2003ISBN0471142735,9780471142737,通过援引将其内容均完整收入本文。术语“降低”,“减少”,“减轻”,或“抑制”均在本文中用于表示降低统计学上显著的量。在一些实施方案中,“降低”,“减少”,“减轻”,或“抑制”典型地表示与参照水平例如在给定治疗,药剂,突变,或删除缺失下相比降低至少10％且可以包括例如降低至少约10％,至少约20％,至少约25％,至少约30％,至少约35％,至少约40％,至少约45％,至少约50％,至少约55％,至少约60％,至少约65％,至少约70％,至少约75％,至少约80％,至少约85％,至少约90％,至少约95％,至少约98％,至少约99％,或更多。如本文中使用的,“降低”或“抑制”并不涵盖与参照水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参照水平相比的100％抑制。在适用时,降低可以是优选下降至对于没有给定病症的个体正常的范围内可接受的水平。术语“提高”,“增加”,“增强”,或“活化”均在本文中用于表示提高统计学上显著的量。在一些实施方案中,术语“提高”,“增加”,“增强”,或“活化”可以表示与参照水平相比提高至少10％,例如与参照水平相比提高至少约20％,或至少约30％,或至少约40％,或至少约50％,或至少约60％,或至少约70％,或至少约80％,或至少约90％或高至且包括100％增量,或10-100％之间的任何增量,或与参照水平相比至少约2倍,或至少约3倍,或至少约4倍,或至少约5倍或至少约10倍增量,或2倍和10倍之间的任何增量或更大。在标志物或症状的背景中,“升高”是此类水平的统计学上显著的升高。如本文中使用的,“受试者”表示人或动物。通常,动物脊椎动物,诸如灵长动物,啮齿动物,驯养动物,或狩猎动物。灵长动物包括例如黑猩猩,食蟹猴,蜘蛛猴,和猕猴,例如恒河猴。啮齿动物包括例如小鼠,大鼠,土拨鼠,雪貂,家兔和仓鼠。驯养和狩猎动物包括例如牛,马,猪,鹿,野牛,水牛,猫科动物,例如驯养的猫,犬科动物,例如犬,狐狸,狼,鸟类物种,例如鸡,鸸鹋,鸵鸟,和鱼,例如鳟鱼,鲶鱼和鲑鱼。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物,例如灵长动物,例如人。术语“个体”,“患者”,和“受试者”在本文中可互换使用。优选地,受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人,非人灵长动物,小鼠,大鼠,犬,猫,马,或牛,但是不限于这些例子。除了人以外的哺乳动物可以有利地用作受试者,代表疾病例如癌症的动物模型。受试者可以是雄性男性或雌性女性,而且可以是幼体儿童或成体成人。受试者可以是先前诊断有或鉴定为罹患或具有需要治疗的状况例如白血病或另一种类型的癌症,等等,例如传染病,自身免疫性疾病,或移植的效应或一种或多种与此类状况有关的并发症的,和任选早就为了状况或一种或多种与状况有关的并发症而经历治疗的。或者,受试者还可以是先前没有诊断为具有此类状况或相关并发症的。例如,受试者可以是展现状况或一种或多种与状况有关的并发症的一种或多种风险因子的或不展现风险因子的受试者。为了特定状况“需要治疗的受试者”可以是具有该状况,诊断为具有该状况,或有风险发生该状况的受试者。“疾病”是如下的动物例如人的健康状态,其中动物不能维持体内稳态,且其中如果疾病没有减轻,那么动物的健康继续恶化。与之对比,动物中的“病症”是如下的健康状态,其中动物能够维持体内稳态,但其中动物的健康状态不如在病症缺失下有利。如果不治疗,病症并不必然引起动物的健康状态进一步降低。如本文中使用的,术语“肿瘤抗原”和“癌抗原”可互换使用,指由癌细胞差异表达且由此可用于靶向癌细胞的抗原。癌抗原是能潜在刺激明显肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码,尽管并不必然表达。这些抗原可以表征为那些在正常细胞中在正常情况下沉默的即不表达的,那些仅仅在分化的某些阶段表达的,和那些时间性表达的,诸如胚胎和胎儿抗原。其它癌抗原由突变细胞基因编码,诸如癌基因例如活化的ras癌基因,抑制基因例如突变体p53,和源自内部删除或染色体易位的融合蛋白。仍有其它癌症抗原可以由病毒基因编码,诸如那些在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的。已经就多种实体瘤而言定义了许多肿瘤抗原:MAGE1,2,和3,通过免疫性来定义；MART-1Melan-A,gp100,癌胚抗原CEA,HER2,粘蛋白即MUC-1,前列腺特异性抗原PSA,和前列腺酸性磷酸酶PAP。另外,病毒蛋白,诸如由乙型肝炎病毒HBV,埃巴二氏病毒EBV,和人乳头瘤病毒HPV编码的一些,已经显示分别在肝细胞癌,淋巴瘤,和宫颈癌的发生中是重要的。如本文中使用的,术语“嵌合”指至少两种或更多种不同多核苷酸分子的部分的融合产物。在一个实施方案中,术语“嵌合”指经由操作已知元件或其它多核苷酸分子而生成的基因表达元件。在一些实施方案中,“活化”可以指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。在一些实施方案中,活化可以指诱导的细胞因子生成。在其它实施方案中,活化可以指可检测的效应器功能。最低限度,如本文中使用的,“活化的T细胞”是增殖性T细胞。如本文中使用的,术语“特异性结合”指两个分子,化合物,细胞,和或颗粒之间的物理相互作用,其中第一实体以比它结合第三非靶实体更大的特异性和亲和力结合第二靶实体。在一些实施方案中,特异性结合可以指在相同条件下第一实体对第二靶实体的亲和力比对第三非靶实体的亲和力大至少10倍,至少50倍,至少100倍,至少500倍,至少1000倍,或更多。对给定靶特异性的试剂是在所利用的测定法的条件下展现对该靶的特异性结合的试剂。一个非限制性例子包括识别并结合关联结合配偶例如T细胞上存在的刺激性和或共刺激性分子蛋白的抗体或配体。如本文中使用的,“刺激性配体”指当在抗原呈递细胞APC,例如巨噬细胞,树突细胞,B细胞,人工APC,等等上存在时能特异性结合T细胞上的关联结合配偶在本文中称作“刺激性分子”或“共刺激性分子”,由此介导T细胞的初级应答,包括但不限于增殖,活化,启动免疫应答,等等的配体。刺激性配体是本领域公知的且格外涵盖加载有肽的MHCI类分子,抗CD3抗体,超激动性抗CD28抗体,和超激动性抗CD2抗体。如该术语在本文中使用的,“刺激性分子”表示T细胞上特异性结合抗原呈递细胞上存在的关联刺激性配体的分子。如该术语在本文中使用的,“共刺激性配体”包括APC上特异性结合T细胞上的关联共刺激性分子,由此提供在通过例如TCRCD3复合物结合加载有肽的MHC分子提供的主要信号以外介导T细胞应答,包括但不限于增殖,活化,分化,等等的信号的分子。共刺激性配体可以包括但不限于4-1BBL,OX40L,CD7,B7-1CD80,B7-2CD86,PD-L1,PD-L2,诱导型共刺激性配体ICOS-L,细胞间粘附分子ICAM,CD30L,CD40,CD70,CD83,HLA-G,MICA,MICB,HVEM,淋巴毒素β受体,3TR6,ILT3,ILT4,HVEM,结合Toll样受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激性配体还可以包括但不限于特异性结合T细胞上存在的共刺激性分子,诸如但不限于CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1LFA-1,CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3的抗体,和特异性结合CD83的配体。“共刺激性分子”指T细胞上特异性结合共刺激性配体,由此介导T细胞的共刺激性应答,诸如但不限于增殖的关联结合配偶。共刺激性分子包括但不限于MHCI类分子,BTLA,Toll样受体,CD27,CD28,4-1BB,OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1LFA-1,CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,和CD83。在一个实施方案中,如本文中使用的,术语“经修饰的”或“经改造的”和它们的语法等同物可以指一处或多处人设计的对核酸,例如生物体的基因组内的核酸的改变。在另一个实施方案中,经改造的可以指基因的改变,添加,和或删除。“经修饰的细胞”或“经改造的细胞”可以指添加,删除和或改变了基因的细胞。如本文中使用的,术语“细胞”,“经修饰的细胞”,或“经改造的细胞”和它们的语法等同物可以指人或非人动物起源的细胞。如本文中使用的,术语“可操作连接”指第一多核苷酸分子,诸如启动子与第二可转录多核苷酸分子,诸如感兴趣基因连接,其中多核苷酸分子的排列使得第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。两种多核苷酸分子可以是或不是单一连续多核苷酸分子的部分且可以是或不是相邻的。例如,如果在细胞中启动子调解或介导感兴趣基因的转录的话,启动子与感兴趣基因是可操作连接的。在本文中描述的各种实施方案中,进一步涵盖的是涵盖所描述的任何特定多肽的变体天然发生的或其它的,等位基因,同源物,保守修饰的变体,和或保守替代变体。对于氨基酸序列,普通技术人员会认识到在改变导致氨基酸用化学上相似的氨基酸替代且保留多肽的期望活性的情况中,改变所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸,肽,多肽,或蛋白质序列的个别替代,删除,或添加是“保守修饰变体”。此类保守修饰变体补充且不排除与本公开一致的多态性变体,物种间同源物,和等位基因。给定氨基酸可以用具有相似的生理化学特征的残基替换,例如用一种脂肪族残基替代另一种诸如Ile,Val,Leu,或Ala彼此替代,或一种极性残基替代另一种诸如Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间。其它此类保守替代例如具有相似疏水性特征的整个区域的替代是公知的。可以在本文中描述的任一种测定法中测试包含保守氨基酸替代的多肽以确认天然或参照多肽的期望活性例如配体介导的受体活性和特异性得到保留。氨基酸可以依照它们侧链特性的相似性来分组A.L.Lehninger,inBiochemistry,seconded.,pp.73-75,WorthPublishers,NewYork1975:1非极性的:AlaA,ValV,LeuL,IleI,ProP,PheF,TrpW,MetM；2不带电荷的极性的:GlyG,SerS,ThrT,CysC,TyrY,AsnN,GlnQ；3酸性的:AspD,GluE；4碱性的:LysK,ArgR,HisH。或者,天然发生残基可以基于共同的侧链特性来分成各组:1疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；2中性的亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；3酸性的:Asp,Glu；4碱性的:His,Lys,Arg；5影响链取向的残基:Gly,Pro；6芳香族的:Trp,Tyr,Phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的。特定的保守替代包括例如Ala变成Gly或变成Ser；Arg变成Lys；Asn变成Gln或变成His；Asp变成Glu；Cys变成Ser；Gln变成Asn；Glu变成Asp；Gly变成Ala或变成Pro；His变成Asn或变成Gln；Ile变成Leu或变成Val；Leu变成Ile或变成Val；Lys变成Arg,变成Gln或变成Glu；Met变成Leu,变成Tyr或变成Ile；Phe变成Met,变成Leu或变成Tyr；Ser变成Thr；Thr变成Ser；Trp变成Tyr；Tyr变成Trp；和或Phe变成Val,变成Ile或变成Leu。在一些实施方案中,本文中描述的多肽或编码此类多肽的核酸可以是本文中描述的氨基酸序列之一的功能性片段。如本文中使用的,“功能性片段”是肽的依照本领域知道的或本文中下文描述的测定法保留野生型参照多肽的活性的至少50％的片段或区段。功能性片段可以包含本文中公开的序列的保守替代。在一些实施方案中,本文中描述的多肽可以是如本文中描述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中,变体是保守修饰的变体。可以通过例如突变天然核苷酸序列来获得保守替代变体。如本文中提到的,“变体”是与天然或参照多肽实质性同源的,但因一处或多处删除,插入或替代而具有与天然或参照多肽不同的氨基酸序列的多肽。编码变体多肽的DNA序列涵盖与天然或参照DNA序列相比包含一处或多处核苷酸添加,删除,或替代,但编码保留非变体多肽的活性的变体蛋白或其片段的序列。极其多种基于PCR的位点特异性诱变办法是本领域知道的且可以由普通技术人员应用。变体氨基酸或DNA序列可以与天然或参照序列至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或更多同一。可以例如通过使用万维网上免费可得的普遍用于这种目的的计算机程序例如BLASTp或BLASTn,以缺省设置比较两种序列来确定天然和突变序列之间同源性的程度百分比同一性。可以通过本领域技术人员知道的多种技术任一来实现对天然氨基酸序列的改变。可以如下例如在特定基因座处引入突变,即合成含有突变序列,侧翼为允许连接至天然序列的片段的限制性位点的寡核苷酸。连接后,所得重新构建的序列编码具有期望氨基酸插入,替代,或删除的类似物。或者,可以采用寡核苷酸指导的位点特异性诱变规程来提供改变的核苷酸序列,其中特定密码子依照所需要的替代,删除,或插入而改变。用于生成此类改变的技术已经完善确立且包括例如下述公开的那些:Walderetal.Gene42:133,1986；Baueretal.Gene37:73,1985；CraikBioTechniques,January1985,12-19；Smithetal.GeneticEngineering:PrinciplesandMethods,PlenumPress,1981；和美国专利No.4,518,584和4,737,462,通过援引将其完整收入本文。还可以替代不牵涉维持多肽的正确构象的任何半胱氨酸残基,一般用丝氨酸,以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反,可以将半胱氨酸键添加至多肽以改善它的稳定性或推动寡聚化。如本文中使用的,术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中与“核酸”可互换使用,指示核苷的聚合物。典型地,多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的在DNA或RNA中天然找到的核苷例如腺苷,胸苷,鸟苷,胞苷,尿苷,脱氧腺苷,脱氧胸苷,脱氧鸟苷,和脱氧胞苷构成。然而,该术语涵盖包含核苷或含有经化学或生物学修饰的碱基,经修饰的主链,等的核苷类似物的分子,无论是否是在天然发生核酸中找到的,而且此类分子对于某些应用可能是优选的。在本申请提到多核苷酸的情况中,理解的是提供DNA,RNA二者,而且在每种情况中提供单和双链形式二者和每种单链分子的互补位。如本文中使用的,“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料自身和或在生物化学上表征特定核酸的序列信息即作为碱基的缩写使用的字母的序列。本文中呈现的多核苷酸序列是以5'至3'方向呈现的,除非另外指明。如本文中使用的,术语“多肽”指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽,典型地长度介于约2和60个氨基酸之间。在本文中使用的多肽典型地含有氨基酸,诸如最常见在蛋白质中找到的20种L-氨基酸。然而,可以使用本领域知道的其它氨基酸和或氨基酸类似物。可以修饰多肽中的一个或多个氨基酸,例如通过添加化学实体,诸如用于连接,官能化,等的碳水化合物基团,磷酸基团,脂肪酸基团,接头。具有与之共价或非共价联合的非多肽模块的多肽仍然认为是“多肽”。例示性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以自天然来源纯化,使用重组DNA技术生成或经由化学手段诸如常规固相肽合成合成,等。如本文中使用的,术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料自身和或在生物化学上表征多肽的序列信息即作为氨基酸名称的缩写使用的字母或三字母代码的序列。本文中呈现的多肽序列是以N端至C端方向呈现的,除非另外指明。在一些实施方案中,编码如本文中描述的多肽例如推动免疫监视规避的蛋白例如TAP抑制剂或HLA同源物,标志物,自杀蛋白,或治疗性蛋白例如CAR多肽的核酸包含在载体内。在本文中描述的一些方面,编码如本文中描述的给定多肽,或其任何模块的核酸序列与载体可操作连接。如本文中使用的,术语“载体”指设计用于投递至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建物。如本文中使用的,载体可以是病毒的或非病毒的。术语“载体”涵盖能够在与适当的控制元件联合时复制且能将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体,表达载体,质粒,噬菌体,转座子,粘粒,人工染色体,病毒,病毒体,等。如本文中使用的,术语“表达载体”指自与载体上的转录调节序列连接的序列指导RNA或多肽表达的载体。所表达的序列常常会是但并非必然是对细胞异源的。表达载体可以包含另外的元件,例如,表达载体可以具有两个复制系统,如此容许它在两种生物体中维持,例如在人细胞中为了表达和在原核宿主中为了克隆和扩增。术语“表达”指在生成RNA和蛋白质和适当时分泌蛋白质中牵涉的细胞过程,在适用时包括但不限于例如转录,转录物加工,翻译和蛋白质折叠,修饰和加工。“表达产物”包括自基因转录的RNA,和通过翻译自基因转录的mRNA而获得的多肽。术语“基因”意味着当与适当的调节序列可操作连接时在体外或在体内将DNA转录成RNA的核酸序列。基因可以包括或不包括在编码区之前和之后的区域,例如5’非翻译5’UTR或“前导”序列和3’UTR或“尾部”序列,以及各个编码区段外显子之间的间插序列内含子。如本文中使用的,术语“病毒载体”指包括至少一种病毒起源的元件且有能力包装至病毒载体颗粒中的核酸载体构建物。病毒载体可以含有编码如本文中描述的多肽的核酸替换非必需的病毒基因。为了在体外或在体内将核酸转移至细胞中的目的可以利用载体和或颗粒。本领域知道众多形式的病毒载体。“重组载体”意味着包括异源核酸序列,或能够在体内表达的“转基因”的载体。应当理解的是,在一些实施方案中,本文中描述的载体可以与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中,载体是附加体。合适的附加体载体的使用提供在高拷贝数染色体外DNA中在受试者中维持感兴趣核苷酸的手段,由此消除染色体整合的潜在影响。任选地,本文中描述的载体可以包括多顺反子构建物,其包括用于表达的多种基因。这些构建物可以包括将不同编码序列分开的接头,其推动对所生成的多蛋白的切割。在各种例子中,接头是或包括病毒2A蛋白例如T2A,P2A,E2A,和F2A。如本文中使用的,术语“治疗”,“处理”,“改善”,或“缓解”指治疗性处理,其中目标是逆转,减轻,缓解,抑制,减缓,或停止与疾病或病症有关的状况的进展或严重程度,例如急性成淋巴细胞性白血病或其它癌症,疾病,或病症。术语“治疗”包括降低或减轻状况,疾病,或病症的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物降低的话,治疗一般是“有效的”。或者,如果疾病的进展降低或停止的话,治疗是“有效的”。也就是,“治疗”不仅包括与在治疗缺失下的预期相比改善症状或标志物,而且包括停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状,减轻疾病的程度,稳定即不恶化疾病的状态,延迟或减缓疾病进展,缓解或缓和疾病状态,减退无论部分或是全部,和或降低死亡率,无论是可检测的或者是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括提供缓解疾病的症状或副作用包括姑息治疗。如本文中使用的,术语“药学组合物”指活性剂与药学可接受载剂例如制药工业中常用的载剂组合。短语“药学可接受的”在本文中用于指在合理医学判断的范围内适合在与人和动物的组织接触中使用而没有过度的毒性,刺激,变异性应答,或其它问题或并发症,与合理的益处风险比相称的那些化合物,材料,组合物,和或剂量形式。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是除了水以外的载剂。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是乳膏,乳液,凝胶,脂质体,纳米颗粒,和或软膏。在任何方面的一些实施方案中,药学可接受载剂可以是人造的或改造的载剂,例如在自然界中不会找到存在活性组分的载剂。如本文中使用的,术语“施用”指通过导致在期望部位至少部分投递药剂的方法或路径将如本文中公开的治疗性或药学组合物放置至受试者中。可以通过在受试者中导致有效治疗的任何适宜的路径来施用包含如本文中公开的药剂的药学组合物。“T细胞”或“T淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中发挥中枢作用的一种类型的淋巴细胞一种亚型的白血细胞。由于细胞表面T细胞受体的表达,T细胞可以与其它淋巴细胞,诸如B细胞和天然杀伤NK细胞区分开。T细胞包括例如幼稚T细胞,中央记忆T细胞,和效应记忆T细胞。如本文中提到的,“经修饰的T细胞”或“经修饰的T淋巴细胞”这些术语在本文中可互换使用是由于例如CD3ζ,TRAC,和或TRBC的删除或突变例如移码突变,或其它敲低或敲除,经过修饰例如经过遗传修饰而具有降低的或消除的即缺无的TCR表达或活性的T细胞。可以进一步修饰“经修饰的T细胞”以表达治疗性蛋白,诸如例如嵌合抗原受体CAR,这使得“经修饰的T细胞”成为CAR-T细胞,其包括CD3ζ,TRAC,和或TRBC相关修饰。还可以任选修饰“经修饰的T细胞”以表达一种或多种推动规避宿主免疫监视的蛋白,例如TAP的抑制剂或HLA同源物,如下文进一步描述的。另外,任选的修饰包括影响HLA表达的突变或删除例如突变或删除染色体6上的HLA基因座,和HLA-G和或HLA-E的表达。术语“统计学上显著的”或“显著”指统计学显著性且一般意味着两个标准偏差2SD或更大差异。除了在操作实施例中以外,或另外指明之处,本文中使用的表示组分或反应条件的数量的所有数值应当理解为在所有情况中通过术语“约”来修饰。术语“约”在联合百分比使用时可以意味着±1％。如本文中使用的,术语“包含”意味着在所呈现的限定要件以外还可以存在其它要件。“包含”的使用表示包括而非限制。术语“由……组成”指如本文中描述的组合物,方法,和其各自成分排除实施方案的该描述中没有提到的任何要件。如本文中使用的,术语“本质上由……组成”指给定实施方案要求的那些要件。该术语允许存在对本技术的该实施方案的基本的和新颖的或功能性的特征没有实质性影响的另外的要件。单数术语“一个一种”和“该所述”包括复数所指物,除非上下文另外清楚指明。类似地,词语“或”意图包括“和”,除非上下文另外清楚指明。虽然在此公开的实践或测试中可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料,但是下文描述了合适的方法和材料。“例如”在本文中用于表示非限制性例子。在任何方面的一些实施方案中,本文中描述的公开不涉及用于克隆人的方法,用于修饰人的种系遗传同一性的方法,人胚胎用于工业或商业目的的用途或用于修饰动物的遗传同一性,很可能导致它们受苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法,还有此类方法产生的动物。其它术语在如本文中下文和其它地方列出的技术的各种方面和实施方案的描述内定义。本发明提供数个优点。例如,没有CD3ζ就不能发生T细胞受体信号传导,所以,依照本发明的某些方面,消除CD3ζ表达则消除GvH疾病的风险。这在经修饰而表达新受体分子例如CAR的T细胞的背景中也是有利的,因为它消除新受体分子与内源T细胞受体信号传导分子之间的竞争。另外,在现有方法例如牵涉删除TRAC序列的方法中,经修饰的T细胞受到接受者的快速排斥,因为它们继续表达它们的同种异体HLA等位基因。本发明解决这个问题,这包括表达能降低排斥发生率的异源蛋白例如病毒蛋白的选项。因而,通过提供能缺乏任何天然T细胞受体表达,以及使细胞规避由接受者的免疫系统介导的排斥二者的经修饰的T细胞,本发明推动过继性T细胞疗法。所得细胞因而使用更安全,而且长效。本发明的另外的特征和优点根据下面的详述,权利要求,和附图会是明显的。附图简述图1显示其中使用CRISPR敲除CD3ζ或TRAC的JurkatT细胞的流式细胞术分析的结果。图2显示其中使用CRISPR敲除CD3ζ或TRAC的原代T细胞的流式细胞术分析的结果。图3显示测试各种针对CD3ζ的gRNA的功效的T7E1破坏测定法的结果。图4显示CD3e负选择后细胞的流式细胞术分析的结果。图5显示CD3e消减后亲本Jurkat细胞,以及其中使用gRNA2敲除CD3ζ的细胞的单细胞分选的结果。图6显示分选后单细胞克隆扩充的结果。图7显示用CAR转导亲本和CD3ζ敲除细胞的效率分析的结果。图8显示CAR转导的亲本和CD3ζ敲除细胞的活化分析的结果。图9是作为NunchuckspMGH81和NinjapMGH82设计的载体的示意图,它们可用于修饰T细胞以表达嵌合抗原受体和降低免疫排斥的异源蛋白。图10显示经Ninja载体pMGH82稳定转导的JurkatT细胞的流式细胞术分析的结果。图11显示经Nunchucks载体pMGH81稳定转导的Raji肿瘤细胞的流式细胞术分析的结果。图12显示分选的经Nunchucks载体pMGH81稳定转导的Raji肿瘤细胞的流式细胞术分析的结果。图13显示原代人T细胞中HLAI类上的TAP抑制物BoHV1UL49.5,CMVUS6,EBVBNLF2a,和HSVICP47表达分析的结果。图14显示原代T细胞中TRAC或CD3ζ敲除对TCR的细胞表面表达的分析的结果。发明详述本发明提供T细胞,其由于CD3ζ,T细胞受体α链TRAC,和或T细胞受体β链TRBC序列的突变或删除,经过修饰而具有降低的T细胞受体TCR的表达例如表达的部分降低或表达的完全抑制。在一个例子中,对CD3ζ基因表达的部分或完全抑制是由于例如CD3ζ序列的突变或删除实现的。在CD3ζ缺失下,不能形成T细胞受体复合物。因而,本发明的经修饰的T细胞可以在例如过继性T细胞疗法的背景中作为“通用”T细胞使用。在下文进一步描述的一个例子中,用编码针对例如癌症相关抗原的嵌合抗原受体CAR的序列转导经修饰的T细胞,然后施用于患者以治疗例如癌症。在其它例子中,在传染病或器官移植的背景中使用经修饰的细胞。任选地,进一步修饰经修饰的T细胞,从而避免或降低施用于患者时排斥细胞的发生。这些进一步修饰在同种异体T细胞疗法的背景中是特别有利的,但是在自体办法中也可能是有用的,例如当由自体的,经修饰的T细胞表达异源蛋白时。在经修饰的T细胞以外,本发明还提供使用经修饰的T细胞的方法,以及相关组合物和试剂盒。下文以例示性方式更为详细地描述本发明的经修饰的T细胞,方法,组合物,和试剂盒。T细胞可以在本发明中使用的T细胞例如人T细胞包括自体细胞,即自受试者获得细胞,在离体修饰和扩充之后,稍后要对该受试者施用细胞。例如,可以自具有或诊断为具有癌症,传染病,自身免疫性疾病,或浆细胞病症的个体获得T细胞。还可以自同种异体供体获得T细胞,他们是与细胞的预期接受者相同物种的遗传上不同的个体。典型地自通过例如静脉穿刺或经由植入端口或导管抽取自受试者收集的外周血获得T细胞。任选地,可以通过包括白细胞分离术在内的过程来获得血液,其中自受试者的血液获得白细胞,而将其它血液成分返回受试者。使用本领域知道的方法加工血液或白细胞分离术产物新鲜的或冻存的以富集T细胞。如此,可以进行例如密度梯度离心使用例如Ficoll和或逆流离心淘洗来富集单个核细胞包括T细胞。可以进一步进行采用例如磁珠上包被的CD3CD28抗体或表达例如细胞表面结合的抗CD3和抗CD28抗体片段的人工抗原呈递细胞aAPC见下文的T细胞刺激步骤,从而刺激T细胞和消减其它细胞,例如B细胞。然后可以将富集的T细胞制备物的T细胞提交遗传修饰。作为外周血的替代,可以使用包括骨髓,淋巴结,脾,和肿瘤在内的组织作为T细胞的来源。T细胞可以是人,灵长动物,仓鼠,家兔,啮齿动物,牛,猪,绵羊,马,山羊,犬,或猫起源的,但是可以使用任何其它哺乳动物细胞。在任何方面的某个实施方案中,T细胞是人的。T细胞的修饰依照本发明,可以以数种方式修饰T细胞以增强它们在治疗性方法例如过继性T细胞疗法中的用途。这些修饰包括:i通过例如CD3ζ,TRAC,和或TRBC序列的删除突变例如移码突变来降低CD3ζ,TRAC,和或TRBC表达,ii表达一种或多种推动免疫监视规避的蛋白例如TAP抑制物或HLA同源物或删除HLAI类和表达HLA-G,iii表达标志物和或自杀基因,和或iv表达治疗性蛋白,诸如嵌合抗原受体CAR或异源T细胞受体。下文提供这些类型的修饰中每一种的例子。CD3ζ,TRAC,或TRBC突变和删除T细胞受体复合物包括可变T细胞受体α和β链,以及三种二聚体信号传导分子:CD3δε,CD3γε,和CD3ζζ。依照本发明,CD3ζ在本文中也称作“CD3z”或“CD3泽塔”,TRAC,和或TRBC基因的表达是降低的或消除的。这可以使用本领域知道的多种方法任一来实现。在一个例子中,使用例如基因编辑方法自T细胞的基因组突变或删除CD3ζ序列例如编码或调节序列；参见例如ENSEMBLIDENSG00000198821,到2018年1月10日,TRAC序列例如编码或调节序列,和或TRBC例如编码或调节序列。如此,例如,可以改编采用RNADNA引导的内切核酸酶例如聚簇规则间隔短回文重复CRISPRCas9,Cpf1,和Argonaute,转录活化物样效应器TALE核酸酶,锌指核酸酶ZFN,或大范围核酸酶的办法供本发明中使用。进一步地,改造核酸酶以实现期望的序列特异性且可以在本发明中使用的方法记载于例如Kim2014；Kim2012；Belhajetal.2013；Urnovetal.2010；Bogdanoveetal.2011；Jineketal.2012Silvaetal.2011；Ranetal.2013；Carlsonetal.2012；Guertsetal.2009；Taksuetal.2010；和Watanabeetal.2012；通过援引将其每一篇完整收入本文。在各种例子中,通过基因编辑来生成插入或删除以引起移码突变,导致基因敲除即缺乏功能性基因产物的表达。在某些例子中,靶向靠近蛋白的N端的早期编码区生成此类突变,从而最大化破坏和最小化低水平蛋白质表达的可能性。在各种例子中,可以靶向任何外显子产生移码例如编码序列的外显子。作为一个具体例子,可以靶向更加近端的外显子。在CD3ζ的背景中在本发明中使用的方案的具体例子包括:i电穿孔靶向CD3ζ的引导RNA及编码Cas9内切核酸酶的mRNA,ii电穿孔由预复合引导RNA和cas9内切核酸酶蛋白质构成的核糖核蛋白RNP,和iii使用在CAR慢病毒骨架中编码的人RNA聚合酶启动子表达引导RNA及电穿孔cas9蛋白质或mRNA。或者,可以通过使用抑制性核酸来实现CD3ζ,TRAC,和或TRBC表达的降低或消除。如本文中使用的,“抑制性核酸”指能抑制靶基因或mRNA表达的核酸分子且包括例如双链RNAdsRNA,抑制性RNAiRNA,等等。抑制性核酸技术更加完整地记载于例如Wilson,RC,andDoudna,JA2013AnnualReviewofBiophysics42217-239及其中引用的参考文献。推动免疫监视规避的蛋白的表达特征在于功能性TCR的表达降低或消除由于例如CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因删除,例如移码突变的经修饰的T细胞可以在过继性T细胞疗法方法诸如本文中描述的那些的背景中有利地使用。如下文进一步描述的,可以进一步修饰这些经修饰的T细胞以表达嵌合抗原受体CAR,从而将经修饰的T细胞导向靶细胞例如肿瘤细胞。然而,可以通过一种或多种另外的遗传修饰来进一步改善经修饰的T细胞的功能,特别是在同种异体转移方法的背景中。更加详细地,缺乏内源T细胞受体表达由于例如CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因删除或突变,如本文中描述的的经遗传修饰的T细胞对接受施用的受试者的免疫系统T细胞和NK介导的排斥的攻击易感。可以通过在经修饰的T细胞中表达某些异源蛋白来实现对这种攻击的规避。因而,可以使用这些蛋白的表达来提高施用的经修饰的T细胞的持久性。可以在这种背景中使用的异源蛋白包括例如推动免疫规避的病毒蛋白。这些蛋白的例子描述如下且包括例如与抗原加工有关的转运蛋白TAP抑制物和HLA同源物。这些蛋白的表达在自体设置中也可能是可应用的,其中降低的对表达的转基因的免疫应答可能是需要的。如此,在一个例子中,可以在本发明的经修饰的T细胞中表达TAP的病毒抑制物。TAP在抗原加工,特别是将细胞溶质肽转运至内质网ER中用于MHC呈递中发挥中枢作用。没有有效的TAP转运,细胞就不能加载和表达HLAI类分子,因而,抑制TAP能推动免疫规避。在本发明中可以使用的TAP的病毒抑制物包括例如巨细胞病毒CMV病毒蛋白US6,单纯疱疹病毒HSV病毒蛋白ICP47,牛疱疹病毒-1BoHV-1蛋白UL49.5,和埃巴二氏病毒EBV蛋白BNLF2a。在另一个例子中,在本发明的经修饰的T细胞中表达完整或部分信号肽CMVUL40蛋白。UL40具有与HLAI类的同源性且转运至ER中不需要TAP依赖性加工。转运后,UL40肽能够结合非经典HLA-E,推动表面表达。在表达时,HLA-E会经由抑制性受体CD94NKG2A抑制NK介导的排斥。以这种方式,UL40的表达为经修饰的T细胞提供保护免于宿主免疫系统攻击。在又一个例子中,在本发明的经修饰的T细胞中表达CMVUL18。UL18是一种病毒HLA同源物,其在表达时能够抑制LIR+NK介导的排斥。UL18需要β-2微球蛋白进行细胞表面表达,而且能通过共表达UL40来提升。可以在本发明中使用的HLA同源物的另一个例子是UL142。作为添加编码推动免疫监视规避的蛋白的基因的替代或在其以外,可以进一步修饰本发明的经修饰的T细胞以删除染色体6上的内源HLA基因座。在另一个例子中,靶向B2M基因座EnsemblIDENSG00000166710,到2018年1月10日。如果生成此类删除,那么T细胞会对NK介导的裂解易感。为了抵消这一点,可以转导细胞以表达通用HLA分子HLA-G或提高HLA-E在细胞表面上的表达的蛋白,或蛋白的部分,诸如完整或部分UL40,或UL18。在某些实施方案中,在本发明的经修饰的T细胞中表达表达推动免疫监视规避的蛋白的个别基因。在其它实施方案中,在此类细胞中表达此类蛋白的组合。在具体例子中,使用例如如本文中描述的多顺反子载体一起表达UL40,US6,和UL18。可以与推动免疫监视规避相关地表达的例示性蛋白的序列包括下文列出的那些,以及其功能性变体。报告或自杀基因的表达可以对本发明的经修饰的T细胞进行的另外的修饰包括例如表达一种或多种报告基因。例如,使用抗EGFR单克隆抗体时,在例如毒性的情况中,可以使用缺乏胞内信号传导域的截短的表皮生长因子受体EGFR用于体内消减。另一种例示性修饰包括在本发明的经修饰的T细胞中表达自杀基因。可以这样做以推动外部的,药物介导的对施用的细胞的控制。例如,通过使用自杀基因,可以在例如不良事件的情况中自患者消减经修饰的细胞。在一个例子中,将FK506结合域与胱天蛋白酶9促凋亡分子融合。以这种方式改造的T细胞变成对免疫遏制性药物他克莫司敏感。自杀基因的其它例子是胸苷激酶TK,CD20,胸苷酸激酶,截短的前列腺特异性膜抗原PSMA,截短的低亲和力神经生长因子受体LNGFR,截短的CD19,和经修饰的Fas,通过施用特定分子例如更昔洛韦至TK+细胞或抗体或抗体-药物缀合物可以触发它们进行条件性消融。治疗性蛋白-嵌合抗原受体CAR的表达在上文描述的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因修饰,以及上文描述的另外的任选的修饰以外,可以进一步任选修饰本发明的T细胞以表达治疗性蛋白,诸如嵌合抗原受体CAR。如本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指经改造的T细胞受体,其将配体或抗原特异性移植至T细胞例如幼稚T细胞,中心记忆T细胞,效应记忆T细胞,或其组合上。CAR还称作人工T细胞受体,嵌合T细胞受体,或嵌合免疫受体。CAR将特异性结合在T细胞应答要靶向的细胞的表面上表达的靶例如多肽的嵌合胞外靶结合域放置至包括T细胞受体分子的跨膜域和胞内域的构建物上。在一个实施方案中,嵌合胞外靶结合域包含特异性结合在T细胞应答要靶向的细胞上表达的抗原的抗体例如单链抗体的抗原结合域。CAR的胞内信号传导域的特性可以变化,如本领域知道的和如本文中公开的,但是嵌合靶抗原结合域在嵌合靶抗原结合域结合靶定细胞的表面上靶抗原时使得受体对信号传导活化敏感。就胞内信号传导域而言,所谓的“第一代”CAR包括那些在抗原结合时仅仅提供CD3ζ信号的。所谓的“第二代”CAR包括那些提供共刺激例如CD28或CD137和活化CD3ζ域二者的,而所谓的“第三代”CAR包括那些提供多种共刺激例如CD28和CD137域和活化域例如CD3ζ。在各种实施方案中,选择CAR以具有对靶抗原的高亲和力或亲合力--例如,抗体衍生的靶或抗原结合域一般会具有比天然发生T细胞受体要高的对靶抗原的亲和力和或亲合力。这种特性与能对抗体选择的高特异性组合提供CART细胞的高特异性T细胞靶向。如本文中使用的,“CART细胞”或“CAR-T”指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时,CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合特性,以非MHC约束的方式将T细胞特异性和反应性重新引导朝向选定靶的能力。非MHC约束的抗原识别给予表达CAR的T细胞以不依赖于抗原加工而识别抗原的能力,如此绕开肿瘤逃脱的主要机制。在CAR以外,本发明的CART细胞包括如本文中描述的别的修饰即由于CD3ζ,TRAC,和或TRBC序列的突变或删除,导致降低或消除的TCR表达的修饰,如本文中描述的。这些修饰任选与一种或多种别的修饰组合,包括例如表达一种或多种推动免疫监视规避的蛋白例如TAP抑制物或HLA同源物,自杀基因,和或标志物基因,如上文记录的。作为表达推动免疫监视规避的蛋白的替代,可以对细胞删除染色体6上的HLA基因座的表达,而且进一步任选表达HLA-G,如上文解释的。如本文中使用的,术语“胞外靶结合域”指在细胞的外部找到的足以推动结合靶的多肽。胞外靶结合域会特异性结合它的结合配偶,即靶。作为非限制性例子,胞外靶结合域可以包括抗体的抗原结合域,或识别和结合关联结合配偶例如CD19,BCMA,或CD37蛋白的配体。在此语境中,配体是特异性结合蛋白和或受体的一部分的分子。在本文中描述的方法和组合物中有用的配体的关联结合配偶一般可以在细胞的表面上找到。配体:关联配偶结合可导致携带配体的受体的改变,或生理应答的活化,例如信号传导途径的活化。在一个实施方案中,配体对于基因组可以是非天然的。任选地,配体具有在至少两种物种中保守的功能。在一个实施方案中,胞外靶结合域包含非抗体配体例如增殖诱导配体APRIL。抗体试剂在各种实施方案中,本文中描述的CAR包括抗体试剂或其抗原结合域作为胞外靶结合域。如本文中使用的,术语“抗体试剂”指包括至少一种免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白可变域序列且特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可以包含抗体或包含抗体的抗原结合域的多肽。在任何方面的一些实施方案中,抗体试剂可以包含单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合域的多肽。例如,抗体可以包括一个重H链可变区在本文中缩写为VH,和一个轻L链可变区在本文中缩写为VL。在另一个例子中,抗体包括两个重H链可变区和两个轻L链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段例如单链抗体,Fab和sFab片段,Fab'2,Fd片段,Fv片段,scFv,CDR,和域抗体dAb片段参见例如deWildtetal.,EurJ.Immunol.1996；263:629-39；通过援引将其完整收入本文以及完整抗体。抗体可以具有IgA,IgG,IgE,IgD,或IgM以及亚类和其组合的结构特征。抗体可以来自任何来源,包括小鼠,家兔,猪,大鼠,和灵长动物人和非人灵长动物和灵长化抗体。抗体还包括微抗体midibodies,人化抗体,嵌合抗体,等等。例如,可以使用本领域普通技术人员知道的方法自噬菌体展示文库选择完全人抗体结合域。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补决定区”“CDR”的具有高变性的区域,间隔称作“框架区”“FR”的更加保守的区域。已经精确定义了FR和CDR的范围参见Kabat,E.A.,etal.1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,和Chothia,C.etal.1987J.Mol.Biol.196:901-917；通过援引将其完整收入本文。每个VH和VL典型地由三个CDR和四个FR构成,自氨基端至羧基端以下面的次序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,和FR4。在一个实施方案中,抗体或抗体试剂不是人抗体或抗体试剂例如,抗体或抗体试剂是小鼠的,但是已经人化。“人化抗体或抗体试剂”指已经在蛋白质序列水平经过修饰以提高它与在人中天然生成的抗体或抗体试剂变体的相似性的非人抗体或抗体试剂。一种人化抗体的办法采用将鼠或其它非人CDR移植至人抗体框架上。在一个实施方案中,CAR的胞外靶结合域包含通过经由柔性接头肽融合抗体一般是单克隆抗体的VH和VL域产生的单链FvscFv片段或本质上由其组成。在各种实施方案中,scFv是与跨膜域和与T细胞受体胞内信号传导域例如如本文中描述的改造的胞内信号传导域融合的。在一个实施方案中,在本文中描述的技术中有用的CAR包含至少两个抗原特异性靶向区,一个胞外域,一个跨膜域,和一个胞内信号传导域。在此类实施方案中,两个或更多个抗原特异性靶向区靶向至少两种不同抗原且可以串联排列并通过接头序列分开。在另一个实施方案中,CAR是双特异性CAR。双特异性CAR是对两种不同抗原特异性的。靶抗原可以通过CAR靶向任何细胞表面模块。最常见的是,靶会是在希望将T细胞应答靶向的细胞上差异或优先表达的细胞表面多肽。在这点上,肿瘤抗原或肿瘤相关抗原是有吸引力的靶,提供靶向肿瘤细胞,同时避免或至少限制对非肿瘤细胞或组织的附带损伤的手段。肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CD19,BCMA,CD37,CEA,未成熟层粘连蛋白受体,TAG-72,HPVE6和E7,BING-4,钙活化氯化物通道2,细胞周期蛋白B1,9D7,Ep-CAM,EphA3,Her2neu,端粒酶,间皮素,SAP-1,存活素,BAGE家族,CAGE家族,GAGE家族,MAGE家族,SAGE家族,XAGE家族,NY-ESO-1LAGE-1,PRAME,SSX-2,Melan-AMART-1,Gp100pmel17,酪氨酸酶,TRP-1-2,MC1R,BRCA12,CDK4,MART-2,p53,Ras,MUC1,和TGF-βRII。在一个实施方案中,靶是B细胞成熟抗原BCMA,也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员17TNFRSF17。BCMA是一种优先在特异性识别B细胞活化因子BAFF的成熟B淋巴细胞上表达的细胞表面受体。知道多种物种的BCMA序列,例如人BCMANCBI基因ID:608多肽例如NCBIRefSeqNP_001183.2和mRNA例如NCBIRefSeqNM_001192.2。BCMA可以指人BCMA,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,BCMA可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的BCMA。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人BCMA的同源物和或直向同源物,例如为给定物种为与参照BCMA序列相似的序列使用NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。在一个实施方案中,BCMA结合序列包含BCMA的配体或特异性结合BCMA的抗体试剂。在一个实施方案中,特异性结合BCMA的抗体试剂是来自人化抗BCMA鼠抗体的scFv。人化鼠抗体衍生的单链可变片段的取向可以是VL-VH或VH-VL。在一个实施方案中,靶是CD37。CD37是含有四个疏水性跨膜域的细胞表面蛋白。CD37唯独在免疫细胞上表达；CD37在成熟B细胞上高表达,而且在T细胞和髓样细胞上中等表达。知道多种物种的CD37序列,例如人CD37NCBI基因ID:951多肽例如NCBIRefSeqNP_001035120.1和mRNA例如NCBIRefSeqNM_001040031.1。CD37可以指人CD37,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,CD37可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的CD37。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人CD37的同源物和或直向同源物,例如为给定物种为与参照CD37序列相似的序列使用NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。在一个实施方案中,CD37结合序列包含CD37的配体或特异性结合CD37的抗体试剂。跨膜域如本文中描述的每种CAR必然包括将胞外靶结合域连接至胞内信号传导域的跨膜域。如本文中使用的,“跨膜域”TM域指CAR中穿越细胞的质膜的一般疏水性的区域。TM域可以是跨膜蛋白例如I型跨膜蛋白或其它跨膜蛋白的跨膜区或其片段,人工疏水性序列,或其组合。虽然本文中提供了具体例子,但是其它跨膜域会是本领域技术人员显而易见的且可以与该技术的备选实施方案联合使用。选定的跨膜区或其片段会优选不干扰CAR的预定功能。如关于蛋白或多肽的跨膜域使用,“其片段”指跨膜域中足以将蛋白锚定或附着至细胞表面的部分。在一个实施方案中,CAR的跨膜域或其片段衍生自或包含CD8的跨膜域。在一个备选实施方案中,本文中描述的CAR的跨膜域或其片段包含选自T细胞受体α,β或ζ链,CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154,KIRDS2,OX40,CD2,CD27,LFA-1CD11a,CD18,ICOSCD278,4-1BBCD137,GITR,CD40,BAFFR,HVEMLIGHTR,SLAMF7,NKp80KLRF1,CD160,CD19,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Ra,ITGA1,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,DNAM1CD226,SLAMF4CD244,2B4,CD84,CD96Tactile,CEACAM1,CRTAM,Ly9CD229,CD160BY55,PSGL1,CD100SEMA4D,SLAMF6NTB-A,Ly108,SLAMSLAMF1,CD150,IPO-3,BLAMESLAMF8,SELPLGCD162,LTBR,PAGCbp,NKp44,NKp30,NKp46,NKG2D,和或NKG2C的跨膜域的跨膜域。CD8是一种优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上找到的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用,且作为T细胞共受体起作用。CD8由αCD8α和βCD8β链组成。知道多种物种的CD8α序列,例如人CD8α,NCBI基因ID:925多肽例如NCBIRefSeqNP_001139345.1和mRNA例如NCBIRefSeqNM_000002.12。CD8可以指人CD8,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,CD8可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的CD8。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人CD8的同源物和或直向同源物,例如为给定物种为与参照CD8序列相似的序列使用该NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。共刺激域本文中描述的每种CAR可以包含共刺激分子的胞内域,或共刺激域。如本文中使用的,术语“共刺激域”指共刺激分子的胞内信号传导域。共刺激分子是在结合抗原后提供T淋巴细胞的有效活化和功能需要的第二信号的除了抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子。此类共刺激分子的例示性例子包括CARD11,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CD54ICAM,CD83,CD134OX40,CD1374-1BB,CD150SLAMF1,CD152CTLA4,CD223LAG3,CD270HVEM,CD273PD-L2,CD274PD-L1,CD278ICOS,DAP10,LAT,NKD2CSLP76,TRIM,和ZAP70。在一个实施方案中,胞内域是4-1BB的胞内域。4-1BBL是一种属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL在活化的T淋巴细胞上表达。知道多种物种的4-1BBL序列,例如人4-1BBL,也称作TNFSF9NCBI基因ID:8744多肽例如NCBIRefSeqNP_003802.1和mRNA例如NCBIRefSeqNM_003811.3。4-1BBL可以指人4-1BBL,包括其天然发生变体,分子,和等位基因。在任何方面的一些实施方案中,例如在兽医应用中,4-1BBL可以指例如犬,猫,牛,马,猪,等等的4-1BBL。本领域技术人员容易为此类物种鉴定人4-1BBL的同源物和或直向同源物,例如为给定物种为与参照4-1BBL序列相似的序列使用NCBI直向同源物搜索功能或搜索可得序列数据。胞内信号传导域如本文中描述的CAR包含胞内信号传导域。“胞内信号传导域”指CAR多肽中参与将有效CAR结合靶抗原的信息转导至免疫效应细胞的内部中以引发效应器细胞功能例如活化,细胞因子生成,增殖,和细胞毒性活性,包括将细胞毒性因子释放至CAR结合的靶细胞,或在抗原结合胞外CAR域后引发的其它细胞应答的部分。如上文记录的,CD3是一种在与适宜的共刺激例如共刺激分子的结合同时啮合时推动T淋巴细胞活化的T细胞共受体。CD3复合物由4条不同链组成；哺乳动物CD3由一条CD3γ链,一条CD3δ链,和两条CD3ε链组成。这些链与称作T细胞受体TCR和CD3ζ的分子联合以生成T淋巴细胞中的活化信号。完整的TCR复合物包含TCR,CD3ζ,和完整的CD3复合物。在任何方面的一些实施方案中,本文中描述的CAR多肽包含包含来自CD3泽塔CD3ζ的免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM的胞内信号传导域。在任何方面的一些实施方案中,ITAM包含三个CD3ζ的ITAM的基序ITAM3。在任何方面的一些实施方案中,三个CD3ζ的ITAM的基序是突变的。知道ITAM是主要信号传导域,其或是以刺激性方式或是以抑制性方式调节TCR复合物的主要活化。以刺激性方式起作用的主要信号传导域可以含有称作免疫受体基于酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在该技术中特别有用的含有ITAM的胞内信号传导域的非限制性例子包括那些自TCRζ,FcRγ,FcRβ,CD3γ,CD3θ,CD3δ,CD3ε,CD3ζ,CD22,CD79a,CD79b,和CD66d衍生的。本领域技术人员会能够使用标准技术将突变引入至基因或基因产物的核酸序列中,例如ITAM。例如,可以经由定点诱变,PCR技术引入点突变。定点诱变试剂盒是商购可得的,例如经由NewEnglandBiolabs；Ipswich,MA。将点突变引入至基因或基因产物的核酸序列中的备选方法的非限制性例子包括盒式诱变或全质粒诱变。在一个实施方案中,CAR中利用的ITAM基于CD3ζ的备选,包括突变的来自CD3ζ的ITAM其含有3个ITAM基序,CD3ζ的截短,和称作CD3ε,CD3θ的可变剪接变体,和改造成表达CD3ε或CD3θ和CD3ζ之间的融合物的人工构建物。在一个实施方案中,CD3ζITAM3序列对应于SEQIDNO:9的序列；或包含SEQIDNO:9的序列；或包含与SEQIDNO:9的序列具有至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或更大序列同一性的序列。在一个实施方案中,胞内信号传导域包含选自SEQIDNO:9,10,11,或12的CD3ζITAM3序列。在一个实施方案中,将酪氨酸残基突变成苯丙氨酸残基,由此抑制天然酪氨酸残基的磷酸化。可以突变的例示性酪氨酸残基包括涵盖的是可以将酪氨酸残基突变成导致抑制酪氨酸磷酸化的任何残基。在任何方面的另一个实施方案中,突变至少一个,至少两个,或所有三个ITAM例如ITAMI,II,和III中的酪氨酸。在一个实施方案中,T细胞胞内信号传导域包含CD3伊塔CD3ε,CD3西塔CD3θ,或CD3ζ的ITAM。在一个实施方案中,T细胞胞内信号传导域是CD3伊塔CD3ε,CD3西塔CD3θ或CD3ζ的ITAM。在一个实施方案中,胞内信号传导域包含相对于SEQIDNO:9的CD3ζITAM3序列包含删除的CD3ζITAM3序列。下文提供了SEQIDNO:9的序列,继以关于SEQIDNO:10,11,和12的另外的信息:RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQIDNO:9CD3ζ-mutITAM1SEQIDNO:10。如本文中描述的,突变CD3ζ-ITAM3中的某些残基以抑制CD3ζ-ITAM3的功能,即:Y21和Y32。下文以粗体类型描绘这些残基的位置。RVKFSRSADAPAYQQGQNQLFNELNLGRREEFDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQIDNO:10CD3ζ-mutITAM1和mutITAM2SEQIDNO:11。如本文中描述的,突变CD3ζ-ITAM3中的某些残基以抑制CD3ζ-ITAM3的功能,即:Y21,Y32,Y59和Y71。下文以粗体类型描绘这些残基的位置。RVKFSRSADAPAYQQGQNQLFNELNLGRREEFDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRSEQIDNO:11CD3ζ-mutITAM1和mutITAM3SEQIDNO:12。如本文中描述的,突变CD3ζ-ITAM3中的某些残基以抑制CD3ζ-ITAM3的功能,即:Y21,Y32,Y90和Y100。下文以粗体类型描绘这些残基的位置。RVKFSRSADAPAYQQGQNQLFNELNLGRREEFDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPRSEQIDNO:12可以使用本领域公知的技术实施相对于CD3ζITAM3序列的删除,例如CRISPR,TALEN,或ZFN技术还见上文。改造核酸酶以实现期望序列特异性的方法是本领域知道的且描述于例如上文引用的参考文献。关于可以改编用于在本发明中使用的CAR和CART细胞的更加详细的描述可见于例如Mausetal.,Blood2014,123:2624-35；Reardonetal.,Neuro-Oncology2014,16:1441-1458；Hoyosetal.,Haematologica2012,97:1622；Byrdetal.,JClinOncol2014,32:3039-47；Maheretal.,CancerRes2009,69:4559-4562；和Tamadaetal.,ClinCancerRes2012,18:6436-6445；通过援引将其每一篇完整收入本文。在一个实施方案中,CAR进一步包含接头域。如本文中使用的,“接头域”指长度为自约2至100个氨基酸,将如本文中描述的CAR的任何域区连接到一起的寡或多肽区域。在一些实施方案中,接头可以包括或构成为柔性残基,诸如甘氨酸和丝氨酸,使得邻近的,连接的蛋白域相对于彼此自由移动。当期望确保两个邻近域在空间上并不彼此干扰时,可以使用更长的接头。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的例子包括2A接头例如T2A,2A样接头或其功能等同物和其组合。在一个实施方案中,接头区是自Thoseaasigna病毒衍生的T2A。可以在这种技术中使用的接头的非限制性例子包括P2A和F2A。在CAR的背景中使用以外,还可以在本文中描述的多顺反子载体中使用这些可切割接头。在一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含报告分子,例如以允许非侵入性成像例如正电子发射断层照相术PET扫描。在包括报告分子的双特异性CAR中,第一胞外结合域和第二胞外结合域可以包括不同或相同的报告分子。在双特异性CART细胞中,第一CAR和第二CAR可以表达不同或相同的报告分子。在另一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含能单独或与底物或化学药品例如9-[4-[18F]氟-3-羟基甲基丁基]鸟嘌呤[18F]FHBG组合成像的报告分子例如潮霉素磷酸转移酶hph。在另一个实施方案中,如本文中描述的CAR进一步包含能使用非侵入性技术容易地成像的纳米颗粒例如用64Cu2+功能化的金纳米颗粒GNP。为了非侵入性成像标记CART细胞的综述见例如BhatnagarP,etal.,Integr.Biol.Camb.2013Jan；51:231-238,和KeuKV,etal.,SciTranslMed.2017Jan18；9373,通过援引将其完整收入本文。GFP和mCherry在本文中证明是对于T细胞例如CART细胞上表达的CAR成像有用的荧光标签。预期本领域知道的本质上任何荧光蛋白可以作为用于这个目的的荧光标签使用。对于临床应用,CAR不需要包括荧光标签或荧光蛋白。构建物,载体,和表达本发明还提供供生成如本文中描述的经修饰的T细胞中使用的构建物和载体。在各种实施例中,本发明提供每种包括要在本发明的经修饰的T细胞中表达的多种蛋白的分开的编码序列的构建物。这些分开的编码序列可以通过如本文中描述的可切割接头序列彼此分开。例如,编码病毒2A蛋白例如T2A,P2A,E2A,和F2A的序列可以放置在分开的基因之间,而且在转录时能指导在所生成的多蛋白之间的切割。如上文记录的,本发明的构建物和载体可以包括多种不同序列组合任一。例如,本发明的构建物或载体可以包括编码UL40,US6,UL18,HLA-E,和HLA-G例如每一种的一种或多种全长或部分序列的序列,任选与CAR组合。用于在本发明的经修饰的T细胞中表达的包括编码蛋白的序列的构建物可以包含在本发明也提供的载体内。在各种实施例中,载体是逆转录病毒载体。逆转录病毒诸如慢病毒为投递编码基因或感兴趣嵌合基因的核酸序列提供方便的平台。可以使用本领域知道的技术将选定的核酸序列插入至载体中并在逆转录病毒颗粒中包装。然后可以分离重组病毒并投递至细胞,例如在体外或离体。逆转录病毒系统是本领域公知的且描述于例如美国专利No.5,219,740；KurthandBannert2010“Retroviruses:MolecularBiology,GenomicsandPathogenesis”CalsterAcademicPressISBN:978-1-90455-55-4；和HuandPathak,PharmacologicalReviews,2000,52:493-512；通过援引将其完整收入本文。用于有效DNA投递的慢病毒系统可以购自OriGene；Rockville,MD。在各种实施方案中,使用本领域知道的载体和方法,通过包含编码蛋白的核酸的表达载体的转染或电穿孔,在T细胞中表达蛋白。可以使用检测编码蛋白的核酸的mRNA,DNA,或基因产物的标准测定法评估如本文中描述的经修饰的T细胞中蛋白的有效表达。例如,可以使用RT-PCR,FACS,Northern印迹,Western印迹,ELISA,或免疫组织化学。在各种实施方案中,组成性表达本文中描述的蛋白。在其它实施方案中,由重组核酸序列编码蛋白。治疗性方法,组合物,和试剂盒本发明提供供治疗和预防有需要的受试者例如具有或诊断为具有疾病或状况的受试者中的疾病和状况中使用的方法和组合物,包括例如癌症,传染病,自身免疫性疾病或病症,浆细胞疾病或病症,或涉及移植的状况。这些方法包括以本文中描述的方式修饰T细胞,然后将经修饰的T细胞施用于受试者。在任何方面的一些实施方案中,在施用于受试者前刺激和或活化经修饰的T细胞例如包括一种或多种如本文中描述的另外的修饰的CAR-T细胞。如本文中使用的,“状况”包括癌症,传染病,自身免疫性疾病或病症,浆细胞疾病或病症,或涉及移植的状况。可以由内科医师使用当前诊断疾病或状况的方法来鉴定具有疾病或状况的受试者。表征这些状况且有助于诊断的疾病或状况的症状和或并发症是本领域公知的且包括但不限于疲劳,持续感染,和持续出血。可能有助于诊断例如疾病或状况的测试包括但不限于血液筛选和骨髓测试,而且是本领域关于给定状况知道的。关于疾病或状况的家族史,或暴露于疾病或状况的风险因子也可能有助于确定受试者是否很可能具有疾病或状况或做出疾病或状况的诊断。如本文中使用的,“癌症”可以指其独特性状—丧失正常细胞控制—导致生长失调,缺乏分化,局部组织侵入,和转移的细胞的高度增殖,而且可以是白血病,淋巴瘤,多发性骨髓瘤,或实体瘤。白血病的非限制性例子包括急性髓样白血病AML,慢性髓样白血病CML,急性淋巴细胞性白血病ALL,和慢性淋巴细胞性白血病CLL。在一个实施方案中,癌症是ALL或CLL。淋巴瘤的非限制性例子包括弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL,滤泡性淋巴瘤,慢性淋巴细胞性白血病CLL,小淋巴细胞性淋巴瘤SLL,套细胞淋巴瘤MCL,边缘区淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,毛细胞白血病HCL。在一个实施方案中,癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性例子包括肾上腺皮质肿瘤,泡状软组织肉瘤,癌瘤,软骨肉瘤,结肠直肠癌,硬纤维瘤,结缔组织增生性小圆细胞肿瘤,内分泌肿瘤,内胚层窦瘤,上皮样血管内皮瘤,尤因肉瘤,生殖细胞瘤实体瘤,骨和软组织的巨细胞瘤,肝母细胞瘤,肝细胞癌,黑素瘤,肾瘤,神经母细胞瘤,非横纹肌肉瘤软组织肉瘤NRSTS,骨肉瘤,脊柱旁肉瘤,肾细胞癌,视网膜母细胞瘤,横纹肌肉瘤,滑膜肉瘤,和威尔姆斯瘤。实体瘤可以是在骨,肌肉,组织,或器官中找到的,而且可以是肉瘤或癌瘤。涵盖的是可以使用本文中描述的技术的任何方面来治疗所有类型的癌症,包括本申请中没有列出的癌症。如本文中使用的,术语“肿瘤”指细胞或组织的异常生长,例如恶性类型或良性类型的。如本文中使用的,“自身免疫性疾病或病症”特征在于一个人的免疫系统没有能力区分外来细胞和健康细胞。这导致一个人的免疫系统靶向一个人的健康细胞进行编程性细胞死亡。自身免疫性疾病或病症的非限制性例子包括炎性关节炎,1型糖尿病,多发性硬化MS,银屑病,炎性肠病,系统性红斑狼疮SLE,血管炎,变应性炎症,诸如变应性哮喘,特应性皮炎,和接触过敏。自身免疫相关疾病或病症的其它例子包括但不限于类风湿性关节炎,格雷夫斯氏病甲状腺活动过度,桥本氏甲状腺炎甲状腺活动不足,乳糜泻,克罗恩氏病,溃疡性结肠炎,格巴二氏综合征,原发性胆汁性硬化硬化症,硬化性胆管炎,自身免疫性肝炎,雷诺氏现象,硬皮病,斯耶格伦氏综合征,古德帕斯丘氏综合征,韦格纳氏肉芽肿病,风湿性多肌痛,颞动脉炎巨细胞动脉炎,慢性疲劳综合征CFS,自身免疫性阿狄森氏病,强直性脊柱炎,急性散性脑脊髓炎,抗磷脂抗体综合征,再生障碍性贫血,特发性血小板减少性紫癜,重症肌无力,视性眼阵挛肌阵挛综合征,视神经炎,Ord氏甲状腺炎,天疱疮,恶性贫血,犬中的多关节炎,莱特尔氏综合征,高安氏动脉炎,温性自身免疫性溶血性贫血,韦格纳氏肉芽肿病,和纤维肌痛FM。在一个实施方案中,为具有导致免疫系统活性异常低的免疫系统病症或阻碍一个人抗击外来细胞即病毒或细菌细胞的能力的免疫缺陷病症的患者获得哺乳动物T细胞。浆细胞是自发挥生成和释放抗击感染需要的抗体的功能的B淋巴细胞生成的白血细胞。如本文中使用的,“浆细胞病症或疾病”特征在于浆细胞增殖异常。异常浆细胞能够“挤出”健康浆细胞,这导致抗击外来物体诸如病毒或细菌细胞的能力降低。浆细胞病症的非限制性例子包括淀粉样变,瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症,骨硬化性骨髓瘤POEMS综合征,意义不明的单克隆丙种球蛋白病MGUS,和浆细胞骨髓瘤。可以将本文中描述的组合物见下文施用于具有或诊断为具有疾病或状况的受试者。在一些实施方案中,本文中描述的方法包含将有效量的本文中描述的经修饰的T细胞例如活化的CART细胞施用于受试者以减轻状况的症状。如本文中使用的,“减轻状况的症状”是缓解任何状况或与状况有关的症状。与等同的未治疗的对照相比,此类降低是至少5％,10％,20％,40％,50％,60％,80％,90％,95％,99％,或更多,如通过任何标准技术测量的。本领域技术人员知道用于将本文中描述的组合物施用于受试者的多种手段。在一个实施方案中,全身或局部施用本文中描述的组合物。在另一个实施方案中,静脉内施用本文中描述的组合物。在另一个实施方案中,在肿瘤部位处施用本文中描述的组合物。如本文中使用的,术语“有效量”指减轻疾病或病症的至少一种或多种症状需要的经修饰的T细胞例如活化的CART细胞的量,而且涉及足够量的细胞制备物或组合物以提供期望的效果。因此,术语“治疗有效量”指在施用于典型的受试者时足以提供特定抗疾病或状况效果的经修饰的T细胞例如活化的CART细胞的量。如本文中使用的,有效量在各种语境中还会包括足以延迟疾病的症状的发生,改变症状疾病的过程例如但不限于减缓疾病或状况的进展,或逆转状况的症状的量。如此,规定确切的“有效量”一般是不切实际的。然而,对于任何给定情况,可以由本领域普通技术人员仅仅使用例行实验确定适宜的“有效量”。可以通过标准药学规程在细胞培养物或实验动物中评估有效量,毒性,和治疗功效。剂量可以随采用的剂量形式和利用的施用路径而变化。毒性和治疗性效果之间的剂量比是治疗指数且可以表述为LD50ED50比。展现较大治疗指数的组合物和方法是优选的。首先可以自细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。还有,可以在动物模型中制定实现包括如在细胞培养物或适宜的动物模型中测定的IC50即实现对症状的半最大抑制的经修饰的T细胞的浓度的循环血浆浓度范围的剂量。例如,可以通过高效液相层析术来测量血浆中的水平。可以通过合适的生物测定法来监测任何特定剂量的效果,例如用于骨髓测试的测定法,等等。可以由内科医师确定剂量并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。在一个方面,本文中描述的技术涉及药学组合物,其包含如本文中描述的经修饰的T细胞,和任选地药学可接受载剂。药学组合物的活性组分最少包含如本文中描述的经修饰的T细胞。在一些实施方案中,药学组合物的活性组分本质上由如本文中描述的经修饰的T细胞组成。在一些实施方案中,药学组合物的活性组分由如本文中描述的经修饰的T细胞组成。用于基于细胞的治疗性配制剂的药学可接受载剂包括盐水和水性缓冲溶液,林格氏溶液,和血清成分,诸如血清清蛋白,HDL,和LDL。诸如“赋形剂”,“载剂”,“药学可接受载剂”,等等术语在本文中可互换使用。在一些实施方案中,包含如本文中描述的经修饰的T细胞的药学组合物可以是胃肠外剂量形式。由于胃肠外剂量形式的施用典型地绕过患者针对污染物的天然防御,所以除了经修饰的T细胞自身以外的成分优选是无菌的或能够在施用于患者前灭菌。胃肠外剂量形式的例子包括但不限于准备好注射的溶液,准备好在用于注射的药学可接受媒介中溶解或悬浮的干燥产品,准备好注射的悬浮液,和乳状液。可以在施用前将任何这些添加至经修饰的T细胞制备物。可用于提供如本文中公开的经修饰的T细胞的胃肠外剂量形式的合适媒介是本领域技术人员公知的。例子包括但不限于:盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介,包括但不限于氯化钠注射液,林格氏注射液,右旋糖注射液,右旋糖和氯化钠注射液,和乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒介,诸如但不限于乙醇,聚乙二醇,和丙二醇；和非水性媒介,诸如但不限于玉米油,棉籽油,花生油,芝麻油,油酸乙酯,肉豆蔻酸异丙酯,和苯甲酸苯甲酯。本发明进一步包括供实施本发明的方法中使用的试剂盒。如此,试剂盒可以任选包括一种或多种用于生成经修饰的T细胞的试剂例如用于实施遗传序列的删除和或添加的核酸分子和或酶。试剂盒可以进一步包括通过本发明的方法生成的“通用”T细胞,其可以作为用于患者治疗的治疗材料的“架上”来源使用。试剂盒可以进一步包括可以用于施用经修饰的T细胞的仪器或装置,以及任选地,关于使用本发明的组合物和方法的用法说明书。剂量当该术语在本文中使用时,“单位剂量形式”指适合于一次施用的剂量。举例而言,单位剂量形式可以是配置在投递装置例如注射器或静脉内滴注袋中的治疗剂的量。在一个实施方案中,在单次施用中施用一个单位剂量形式。在另一个实施方案中,可以同时施用超过一个单位剂量形式。在一些实施方案中,作为单一疗法施用本文中描述的经修饰的T细胞,即没有对受试者并行施用针对状况的另一种治疗。一般可以以104至109个细胞kg体重,在一些情况中105至106个细胞kg体重的剂量施用包含本文中描述的经修饰的T细胞的药学组合物,包括那些范围内的所有整数值。如果有必要,还可以以这些剂量多次施用经修饰的T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中普遍知道的输注技术来施用细胞参见例如Rosenbergetal.,NewEng.J.ofMed.319:1676,1988。在某些方面,可能想要将经修饰的T细胞施用于受试者,然后随后重新取出血液或实施血液成分分离术,如本文中所述活化来自其中的T细胞,并对患者重新输注这些活化和扩充的T细胞。可以每几周进行这个过程多次。在某些方面,可以活化来自10cc至400cc的抽血的T细胞。在某些方面,活化来自20cc,30cc,40cc,50cc,60cc,70cc,80cc,90cc,或100cc的抽血的T细胞。施用的模式可以包括例如静脉内i.v.注射或输注。可以将本文中描述的组合物经动脉,肿瘤内,结内,或髓内施用于患者。在一些实施方案中,可以将经修饰的T细胞的组合物直接注射至肿瘤,淋巴结,或感染部位中。在一个实施方案中,将本文中描述的组合物施用至体腔或体液例如腹水,胸膜液,腹膜液,或脑脊液中。在一个特定例示性方面,且如上文描述的,受试者可以经历白细胞分离术,其中收集白细胞,富集,或离体消减以选择和或分离感兴趣细胞,例如T细胞。这个过程可以包括标准方法,例如通过使用用针对CD3和CD2的抗体包被的磁珠进行的刺激。或者,可以通过与人工抗原呈递细胞aAPC接触来扩充T细胞。将这些细胞改造成表达嵌合刺激性受体CSR,而且任选地,通过敲低或灭活低密度脂蛋白受体LDLR表达来修饰细胞。每种CSR包含iT细胞共刺激受体例如CD3,CD28,OX40,或4-1BB,等等或T细胞受体的抗体试剂或天然配体；ii接头域,和iii跨膜域。在一个例子中,将aAPC改造成表达针对CD3和CD28的CSR。抗体试剂,接头域,和跨膜域是例如如本文中别处描述的。可以用于生成aAPC的细胞包括例如人细胞,诸如例如红髓样细胞例如K562细胞,髓样细胞,或改造成缺乏HLA表达或功能性HLA的细胞。如此,可以通过与如本文中描述的aAPC例如表达如本文中描述的抗CD28和抗CD3CDR的aAPC接触来扩充分离的T细胞并处理,使得可以引入该技术的一种或多种CAR构建物,由此产生CART细胞。有需要的受试者随后可以经历高剂量化疗的标准治疗,继以外周血干细胞移植。在移植后或与移植并行,受试者可以接受扩充的CART细胞的输注。在一个实施方案中,在手术之前或之后施用扩充的细胞。在一些实施方案中,在施用如本文中描述的一种或多种经修饰的T细胞前对受试者实施淋巴消减。在此类实施方案中,淋巴消减可以包含施用美法仑,Cytoxan,环磷酰胺,和氟达拉滨中的一种或多种。要施用于患者的上述治疗的剂量会随所治疗的状况的精确性质和治疗的接受者而变化。可以依照本领域公认的实践来实施用于人施用的剂量的缩放。在一些实施方案中,需要单次治疗方案。在其它实施方案中,可以实施一个或多个后续剂量或治疗方案的施用。例如,在每两周治疗达三个月之后,可以每个月重复治疗一次,持续六个月或一年或更久。在一些实施方案中,在初始治疗后不施用另外的治疗。可以由内科医师确定如本文中描述的组合物的剂量并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。就治疗的持续时间和频率而言,典型地是熟练临床医生监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处,及确定是否施用别的细胞,中止治疗,恢复治疗,或做出治疗方案的其它改变。剂量不应大到引起不良副作用,诸如细胞因子释放综合征。一般地,剂量会随患者的年龄,状况,和性别而变化且可以由本领域技术人员确定。还可以由内科医师个体在任何并发症的情况下调整剂量。组合疗法可以与其它已知的药剂和疗法组合使用本文中描述的经修饰的T细胞例如活化的CART细胞。如本文中使用的,“组合”施用意味着在受试者罹患病症例如疾病或状况的过程期间将两种或更多种不同治疗投递至受试者,例如在受试者已经诊断有病症之后和在病症已经治愈或消除或治疗已经出于其它原因而停止之前投递两种或更多种治疗。在一些实施方案中,一种治疗的投递在第二种治疗的投递开始时仍然正在发生,使得就施用而言有交叠。这在本文中有时称作“同时”或“并行投递”。在其它实施方案中,一种治疗的投递在其它治疗的投递开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中,治疗由于组合施用而更加有效。例如,第二种治疗更加有效,例如,对更少的第二种治疗看到等同的效果,或第二种治疗比在第一种治疗缺失下施用第二种治疗会看到的更大程度地减轻症状,或对第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中,投递使得症状减轻,或其它与病症有关的参数大于对在其它治疗缺失下投递一种治疗会观察到的。两种治疗的效果可以是部分叠加,完全叠加,或大于叠加。投递可以使得所投递的第一种治疗的效果在投递第二种治疗时仍然可检测到。可以同时在同一组合物中或在分开的组合物中或顺序施用本文中描述的经修饰的T细胞例如活化的CART细胞和至少一种另外的治疗剂。对于顺序施用,可以第一个施用经修饰的T细胞例如CAR表达性细胞,而且可以第二个施用另外的药剂,或者可以颠倒施用的次序。可以在活动性病症时段期间,或在减退或活动性较低疾病时段期间施用CART疗法和或其它治疗剂,规程,或模态。可以在另一种治疗之前,与治疗并行,治疗后,或在病症减退期间施用经修饰的T细胞疗法。在组合施用时,可以以比个别使用例如作为单一疗法的每种药剂的量或剂量更高,更低,或相同的量或剂量施用经修饰的T细胞和另外的药剂例如第二种或第三种药剂,或所有。在某些实施方案中,施用的经修饰的T细胞,另外的药剂例如第二种或第三种药剂,或所有的量或剂量比个别使用的每种药剂的量或剂量更低例如至少20％,至少30％,至少40％,或至少50％。在其它实施方案中,导致期望效果例如治疗癌症的经修饰的T细胞,另外的药剂例如第二种或第三种药剂,或所有的量或剂量比实现相同治疗效果个别需要的每种药剂的量或剂量更低例如低至少20％,至少30％,至少40％,或至少50％。在别的实施方案中,可以在治疗方案中与手术,化疗,放射,mTOR途径抑制剂,免疫遏制剂,诸如环孢菌素,硫唑嘌呤,甲氨蝶呤,霉酚酸酯,和FK506,抗体,或其它免疫消融剂,诸如CAMPATH,抗CD3抗体或其它抗体疗法,cytoxin,氟达拉滨,雷帕霉素,霉酚酸,类固醇,FR901228,细胞因子,或肽疫苗诸如Izumotoetal.,J.Neurosurg.108:963-971,2008中描述的组合使用本文中描述的经修饰的T细胞。在一个实施方案中,可以与检查点抑制剂组合使用本文中描述的经修饰的T细胞。例示性检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂纳武单抗,MK-3475,派姆单抗,匹迪单抗,AMP-224,AMP-514,抗CTLA4抑制剂伊匹单抗和曲美木单抗,抗PDL1抑制剂阿特珠单抗,阿维单抗,MSB0010718C,MEDI4736,和MPDL3280A,和抗TIM3抑制剂。在一个实施方案中,可以与化疗剂组合使用本文中描述的经修饰的T细胞。例示性化疗剂包括蒽环类抗生素例如多柔比星例如脂质体多柔比星,长春花生物碱例如长春碱,长春新碱,长春地辛,长春瑞滨,烷化剂例如环磷酰胺,达卡巴嗪,美法仑,异环磷酰胺,替莫唑胺,免疫细胞抗体例如阿仑单抗,吉姆单抗,利妥昔单抗,托西莫单抗,抗代谢物包括例如叶酸拮抗剂,嘧啶类似物,嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂例如氟达拉滨,mTOR抑制剂,TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白GITR激动剂,蛋白酶体抑制剂例如阿克拉霉素A,胶霉毒素或硼替佐米,免疫调控剂诸如沙利度胺或沙利度胺衍生物例如来那度胺。考虑供组合疗法中使用的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷,卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺或,阿糖胞苷,胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素放线菌素D,Cosmegan,盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松,多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨,吉西他滨二氟脱氧胞苷,羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙,美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌Mylotarg,帕利他赛Phoenix钇90MX-DTPA,喷司他丁,带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤,塞替派,替拉扎明注射用盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨例示性烷化剂包括但不限于氮芥,乙撑亚胺衍生物,烷基磺酸盐,亚硝基脲,和三氮烯:尿嘧啶芥AminouracilUracilnitrogen,氯甲川chlormethine环磷酰胺RevimmuneTM,异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三乙撑蜜胺三乙撑硫代磷酰胺,替莫唑胺塞替派白消安卡莫司汀洛莫司汀链佐星和达卡巴嗪另外的例示性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺和；更生霉素也称作放线菌素-D,；美法仑也称作L-PAM,L-溶肉瘤素,和苯丙氨酸芥,；六甲蜜胺也称作六甲基密胺HMM,；卡莫司汀苯达莫司汀白消安和；卡铂洛莫司汀也称作CCNU,；顺铂也称作CDDP,和-AQ；苯丁酸氮芥环磷酰胺和；达卡巴嗪也称作DTIC,DIC和咪唑羧酰胺,；六甲蜜胺也称作六甲基密胺HMM,；异环磷酰胺泼尼莫司汀；丙卡巴肼双氯乙基甲胺也称作氮芥,莫司汀和盐酸双氯乙基甲胺,；链佐星塞替派也称作硫代磷酰胺,TESPA和TSPA,；环磷酰胺和盐酸苯达莫司汀例示性mTOR抑制剂包括例如替西罗莫司；ridaforolimus正式称作地膦莫司,1R,2R,45-4-[2R-2[1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04'9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基膦酸酯,也称作AP23573和MK8669,且描述于PCT公开文本No.WO03064383；依维莫司或RADOOI；雷帕霉素AY22989,；塞马莫德CAS164301-51-3；emsirolimus,5-{2,4-双[35,-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基甲醇AZD8055；2-氨基-8-[iraw5,-4-2-羟基乙氧基环己基]-6-6-甲氧基-3-吡啶基-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-78H-酮PF04691502,CAS1013101-36-4；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-a-天冬氨酰L-丝氨酸-,内盐SF1126,CAS936487-67-1,和XL765。例示性免疫调控剂包括例如阿夫土珠单抗可得自；PEG非格司亭来那度胺CC-5013,；沙利度胺actimidCC4047；和IRX-2人细胞因子的混合物,包括白介素1,白介素2,和干扰素γ,CAS951209-71-5,可得自IRXTherapeutics。例示性蒽环类抗生素包括例如多柔比星和；博来霉素柔红霉素盐酸柔红霉素,道诺霉素,和盐酸红比霉素,；柔红霉素脂质体柠檬酸柔红霉素脂质体,；米托蒽醌DHAD,；表柔比星EllenceTM；伊达比星Idamycin；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；灰暗霉素；和脱乙酰基灰暗霉素。例示性长春花生物碱包括例如酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛长春碱也称作硫酸长春碱,长春花碱和VLB,和；和长春瑞滨例示性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡菲佐米非PX-171-007,5-4-甲基-N-5-1-5-4-甲基-1-R-2-甲基氧杂环丙-2-基-1-氧代戊-2-基氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基-2-5,-2-2-吗啉代乙酰氨基-4-苯基丁酰氨基-戊酰胺；marizomibNPT0052；柠檬酸伊沙佐米MLN-9708；德兰佐米CEP-18770；和O-甲基-N-[2-甲基-5-噻唑基羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[11S'-2-[2R-2-甲基-2-氧杂环丙基]-2-氧代-1-苯基甲基乙基]-L-丝氨酰胺ONX-0912。本领域技术人员能容易地鉴定使用的化疗剂例如参见Physicians'CancerChemotherapyDrugManual2014,EdwardChu,VincentT.DeVitaJr.,Jones&BartlettLearning；PrinciplesofCancerTherapy,Chapter85inHarrison’sPrinciplesofInternalMedicine,18thedition；TherapeuticTargetingofCancerCells:EraofMolecularlyTargetedAgentsandCancerPharmacology,Chs.28-29inAbeloff’sClinicalOncology,2013Elsevier；和FischerDSed:TheCancerChemotherapyHandbook,4thed.St.Louis,Mosby-YearBook,2003。在一个例子中,将本文中描述的经修饰的T细胞与降低靶向GITR和或调控GITR功能的分子的水平和或活性的分子,减少Treg细胞群体的分子,mTOR抑制剂,GITR激动剂,激酶抑制剂,非受体酪氨酸激酶抑制剂,CDK4抑制剂,和或BTK抑制剂组合施用于受试者。功效可以由熟练临床医生测定经修饰的T细胞例如活化的CART细胞在例如治疗本文中描述的状况,或诱导如本文中描述的应答例如癌细胞的减少中的功效。然而,在该术语在本文中使用时,如果在依照本文中描述的方法的治疗后,本文中描述的状况的一种或多种体征或症状以有益方式改变,其它临床公认的症状改善,或甚至缓解,或诱导期望的应答,例如至少10％的话,认为治疗是“有效的治疗”。可以例如通过测量依照本文中描述的方法治疗的状况的标志物,指标,症状,和或发生率或任何其它适宜的可测量参数来评估功效。依照本文中描述的方法的治疗能降低状况的标志物或症状的水平,例如至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少40％,至少50％,至少60％,至少70％,至少80％,或至少90％或更多。还可以通过个体没有如通过住院或需要医学干预评估的恶化即疾病的进展停止来测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员知道的和或本文中描述的。治疗包括个体或动物一些非限制性例子包括人或动物中的疾病的任何治疗且包括:1抑制疾病,例如预防症状例如疼痛或炎症恶化；或2减轻疾病的严重程度,例如引起症状消退。治疗疾病的有效量意味着该量在施用于有需要的受试者时足以对该疾病导致有效的治疗如该术语在本文中定义的。可以通过评估状况或期望应答的物理physical指标来测定药剂的功效。通过测量此类参数中的任一个,或参数的任何组合来监测施用和或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力内。可以在本文中描述的状况的动物模型中评估给定办法的功效,例如ALL的治疗。在使用实验性动物模型时,当观察到标志物的统计学显著变化时证明治疗的功效。通过援引明确将贯穿本申请引用的所有专利和其它出版物包括参考文献,已公告的专利,已公布的专利申请,和共同悬而未决的专利申请收入本文,用于描述和公开例如此类出版物中描述的可能与本文中描述的技术联合使用方法学的目的。提供这些出版物仅仅因为它们在本申请的提交日前公开。在这点上任何内容不应解读为承认发明人没有资格凭借在先技术或出于任何其它原因而先于此类公开。所有关于这些文件的日期的声明或关于内容的陈述基于申请人可得的信息且不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。本公开的实施方案的描述并非意图是穷尽的或将本公开限制于所公开的精确形式。虽然本文中为了说明目的描述了本公开的具体实施方案和实施例,但是正如相关领域的技术人员会认识到的,在本公开的范围内各种等同修改是可能的。例如,虽然以给定次序呈现各方法步骤或功能,但是备选实施方案可以以不同次序实施各功能,或者可以实质性并行实施各功能。可以适当地将本文中提供的公开的教导应用于其它规程或方法。可以组合本文中描述的各种实施方案以提供别的实施方案。在必要时可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请中的组合物,功能和概念来提供本公开的还有别的实施方案。此外,由于生物学功能性等同性考虑,可以在蛋白质结构中做出一些变化而不在种类或量上影响生物学或化学作用。可以根据详述对本公开做出这些和其它变化。所有此类修改意图包括在所附权利要求的范围内。可以组合任何前述实施方案的具体要件或替代其它实施方案中的要件。而且,虽然已经在这些实施方案的背景中描述了与本公开的某些实施方案有关的优点,但是其它实施方案也可能展现此类优点,而且并非所有实施方案必须展现此类优点才落在本公开的范围内。通过下面的实施例进一步例示本文中描述的技术,它们绝不应当解读为进一步限制。实施例实施例1:敲除JurkatT细胞和原代T细胞中的CD3ζ,和用CAR转导CD3ζ敲除细胞为了使用CRISPR实现基因敲除,开发了靶向CD3ζ的各种编码序列的指南,目标是CRISPR介导的基因破坏,其通过在靶基因组序列中生成插入和或删除,引起在表达缺失下的移码突变。使用CRISPR敲除Jurkat细胞中的CD3ζ或T细胞受体α链TRAC图1。用于CD3zKO的两种特异性指导序列是iCAGTTGCCGATTACAGGTA和iiGTGGAAGGCGCTTTTCACCG。通过流式细胞术分析所得细胞以显示敲除对CD3T细胞受体复合物的表达的影响。与模拟电穿孔EP细胞相比,和如EP后第7天通过使用抗CD3e抗体测定的,两种敲除均消除这些细胞中CD3T细胞受体的表达。还使用CRISPR敲除原代T细胞中的CD3ζ或TRAC图2。使用抗CD3e抗体,EP后第8天刺激后第12天的流式细胞术分析显示每种敲除均消除这些细胞中CD3T细胞受体复合物的表达。使用酿脓链球菌S.pyogenesCas9SpCas9进行T7E1破坏测定法以筛选在JurkatT细胞系以及原代人T细胞中使用针对CD3ζ的各种gRNA图3获得的百分比基因破坏。使用针对外显子内含子1位点的gRNA2和靶向CD3z外显子1的另外的指导GTGGAAGGCGCTTTTCACCG获得最大破坏。使用磁珠通过CD3e负选择富集使用gRNA2通过CRISPR敲除CD3ζ的Jurkat细胞图4。通过用针对CD3e和TCRab的抗体染色确认T细胞受体敲除。负选择富集大约50％TCR-细胞。将亲本,未修饰的Jurkat细胞,以及使用gRNA2敲除CD3ζ并通过CD3e负选择而富集的细胞提交单细胞分选图5。使用针对TCRab和CD3e的抗体获得的结果显示消除了这些细胞中的T细胞受体表达。在分选后扩充单细胞克隆n＝24并评估CD3ζ和CD3e染色图6。与亲本对照相比,选择显示消除T细胞受体表达的克隆5供功能测定法中使用。利用多种胞内信号传导域,用编码各种针对CD19的CAR的载体转导亲本,未修饰的细胞和如上所述使用CRISPR敲除CD3ζ的细胞。转导后,通过CD3e与各种CAR构建物的组合,对细胞分析T细胞受体表达图7。将CD19CAR转导T细胞用板结合的OKT3抗CD3或Nalm62:1刺激过夜图8。评估NFAT萤光素酶活化。CAR-T细胞是对hCD19特异性的且以95％转导。在CD3ζ敲除Jurkat系中缺乏响应TCR特异性CD3e的NFAT活化。然而,CD3ζ敲除Jurkat系维持对Nalm6的CAR特异性活化。实验重复三次,每种条件N＝3。实施例2:修饰CD3ζ敲除T细胞以降低排斥构建慢病毒载体供转导T细胞中使用图9。NunchuckspMGH81是一种表达3种全长CMV蛋白UL40,US6,和UL18,叩头虫绿色萤光素酶CBG；要用于细胞杀伤测定法和体内成像,增强型绿色荧光蛋白EGFP；用于下游流式分选,和病毒2A蛋白T2a,P2A,E2A,和F2A；用于指导对编码的多蛋白的切割的构建物。如上文解释的,CMV蛋白发挥推动规避对其施用T细胞的接受者的免疫攻击的功能。NinjapMGH82是一种表达经修饰的抗人CD19_BBz嵌合抗原受体,以及CMVUL40CMV病毒蛋白和信号肽的构建物。将信号肽加载至非经典HLA-E上,其在表达时会帮助抑制NK细胞杀伤。还包括CMVUS6和UL18,以及作为转基因表达的报告基因而包括的mCherry。如上文记录的,包括病毒2A元件T2A,P2A,和E2A来指导对编码的多蛋白的切割。用以Ninja载体编码的病毒转导Jurkat和原代人T细胞图10。数据显示编码的蛋白在细胞中表达。用以Nunchucks载体pMGH81编码的病毒转导Raji肿瘤细胞系图11。用自构建物2A元件表达的GFP标记转基因阳性Raji细胞。GFP+细胞具有降低的HLAI类蛋白的表达,如GFP+,HLA低阴性细胞群体中显示的。使用未转导细胞作为对照。如上文讨论的,降低的HLA表达会保护同种异体T细胞产物免于在同种异体T细胞产物输注后受到患者排斥。图12显示分选的表达pMGH81的Raji肿瘤细胞具有降低的HLAI类表达。图13显示原代人T细胞中的TAP抑制物BoHV1UL49.5,CMVUS6,EBVBNLF2a,和HSVICP47表达和所致HLAI类下调敲除。转基因GFP阳性＝HLA-I类阴性。实施例3:敲除T细胞受体α链TRAC使用与上文就CD3ζ而言描述的方法类似的方法靶向TRAC。用于TRAC的特异性gRNA是AGAGTCTCTCAGCTGGTACA。如图14中显示的,原代T细胞中TRACAGAGTCTCTCAGCTGGTACA或CD3ζGTGGAAGGCGCTTTTCACCG的敲除在电穿孔后第8天刺激后第12天引起TCR的细胞表面表达的敲除。在下面编号的段落中描述本发明的各个方面。1.一种分离的T淋巴细胞,其由于降低的或消除的CD3ζ,T细胞受体α链TRAC,和或T细胞受体β链TRBC基因的表达,经过修饰而具有降低的或消除的T细胞受体TCR的表达。2.段落1的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因,调节序列,编码序列,外显子,或其一部分突变,导致降低的,缺无的,或非功能性的CD3泽塔zeta,ζ,CD3伊塔eta,η,CD3西塔theta,θ,TRAC,和或TRBC表达的基因组。3.段落2的分离的T淋巴细胞,其中该突变是删除。该突变可以任选是移码突变或删除。4.段落2或3的分离的T淋巴细胞,其中该突变破坏T细胞受体的装配或CD3ζ信号传导。5.段落1-4任一项的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因删除的基因组。6.段落5的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的两个等位基因删除的基因组。7.段落1-6任一项的分离的T淋巴细胞,其中该降低的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的表达是缺无的表达。8.段落1-7任一项的分离的T淋巴细胞,其具有降低的CD3η或CD3θ的表达。9.段落1-8任一项的分离的T淋巴细胞,其中一个HLA基因座或其一部分是删除的。10.段落9的分离的T淋巴细胞,其中该HLA基因座是在染色体6上的。11.段落1-10任一项的分离的T淋巴细胞,其进一步具有降低的HLAI类表达。12.段落1-11任一项的分离的T淋巴细胞,其中该分离的T淋巴细胞经过进一步修饰而表达HLA-G。13.段落1-12任一项的分离的T淋巴细胞,其进一步包含编码推动T淋巴细胞规避来自对其施用该T淋巴细胞的宿主的免疫攻击的异源蛋白的基因。14.段落13的分离的T淋巴细胞,其中该异源蛋白推动规避T细胞或NK介导的排斥。15.段落13或14的分离的T淋巴细胞,其中该异源蛋白是病毒蛋白。16.段落15的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白来自选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒。17.段落16的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。18.段落16的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP。19.段落18的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。20.段落1-19任一项的分离的T淋巴细胞,其进一步包含编码报告基因的基因。21.段落20的分离的T淋巴细胞,其中该报告基因包含截短的表皮生长因子受体EGFR基因,截短的前列腺特异性膜抗原PSMA,截短的低亲和力神经生长因子受体LNGFR,截短的CD19。22.段落1-21任一项的分离的T淋巴细胞,进一步包含编码治疗性蛋白的基因。23.段落22的分离的T淋巴细胞,其中该治疗性蛋白包含抗原受体。24.段落23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体赋予对选定靶抗原的特异性。25.段落23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体赋予对选定配体的特异性。26.段落23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体是嵌合抗原受体CAR。27.段落26的分离的T淋巴细胞,其中该CAR包含胞外域,跨膜区结构域,和胞内区结构域。28.段落27的分离的T淋巴细胞,其中该胞外域包含单链抗体和该胞内域包含T细胞活化域。29.段落1-28任一项的分离的T淋巴细胞,其进一步包含诱导细胞死亡的基因。30.段落29的分离的T淋巴细胞,其中该基因是可活化的自杀基因。31.段落30的分离的T淋巴细胞,其中该自杀基因是由药物活化的。32.段落31的分离的T淋巴细胞,其中该自杀基因表达与胱天蛋白酶9促凋亡分子融合的FK506结合域。33.一种用于生成经修饰的T淋巴细胞的方法,该方法包含灭活T淋巴细胞中的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因。34.段落33的方法,其中该灭活CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因是使用选自锌指核酸酶ZFN,转录活化物样效应器核酸酶TALEN,和聚簇规则间隔短回文重复CRISPRcas9系统的组的核酸酶或系统进行的。35.段落33或34的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞是段落1-32任一项的经修饰的T淋巴细胞。36.一种针对疾病治疗受试者的方法,该方法包含对该受试者施用段落1-32任一项的分离的T淋巴细胞。37.段落36的方法,其中该疾病选自由癌症,传染病,和移植规程导致的适应症组成的组。38.一种降低受试者中的免疫原性反应的方法,该方法包含对受试者施用依照段落1-32任一项的T淋巴细胞。39.段落38的方法,其中该T淋巴细胞表达转基因。40.段落38的方法,其中该T淋巴细胞具有降低的与内源T细胞受体信号传导分子的竞争。41.段落36-40任一项的方法,其中该T淋巴细胞就该受试者而言是自体的。42.段落36-40任一项的方法,其中该T淋巴细胞就该受试者而言是同种异体的。43.段落36-42任一项的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在体内扩充。44.段落36-43任一项的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在该受试者的血液中扩充。45.段落36-44任一项的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在施用前,在体外扩充。46.一种载体,其包含编码治疗性蛋白和推动免疫系统规避的异源蛋白的基因。47.段落46的载体,其中该异源蛋白是病毒蛋白。48.段落47的载体,其中该病毒蛋白来自选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒。49.段落48的载体,其中该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。50.段落48的载体,其中该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP。51.段落50的载体,其中该病毒蛋白选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。52.段落46-51任一项的载体,其中该治疗性蛋白是CAR。53.一种用一种或多种段落46-52的载体转导T淋巴细胞的方法。54.依照段落33-35或53任一项的方法生成的经修饰的T淋巴细胞或细胞系,或其传代培养物。55.一种药学组合物,其包含至少一种段落1-32任一项的经修饰的T淋巴细胞。56.一种治疗受试者的方法,其包含下述步骤:a依照段落33-35或53任一项的方法制备经修饰的T淋巴细胞的群体,和b将该经修饰的T淋巴细胞施用于该受试者。57.段落56的方法,其中该T淋巴细胞源自要治疗的受试者。58.段落56的方法,其中该T淋巴细胞源自健康供体。序列表综合医院公司（THEGENERALHOSPITALCORPORATION）经修饰的T细胞和它们的使用方法51295-005WO3US62529,1302017-07-06US62519,9602017-06-15US62444,6162017-01-10US62444,5902017-01-1012PatentInversion3.51183PRT人工序列合成构建物1MetAspLeuLeuIleArgLeuGlyPheLeuLeuMetCysAlaLeuPro151015ThrProGlyGluArgSerSerArgAspProLysThrLeuLeuSerLeu202530SerProArgGlnGlnAlaCysValProArgThrLysSerHisArgPro354045ValCysTyrAsnAspThrGlyAspCysThrAspAlaAspAspSerTrp505560LysGlnLeuGlyGluAspPheAlaHisGlnCysLeuGlnAlaAlaLys65707580LysArgProLysThrHisLysSerArgProAsnAspArgAsnLeuGlu859095GlyArgLeuThrCysGlnArgValArgArgLeuLeuProCysAspLeu100105110AspIleHisProSerHisArgLeuLeuThrLeuMetAsnAsnCysVal115120125CysAspGlyAlaValTrpAsnAlaPheArgLeuIleGluArgHisGly130135140PhePheAlaValThrLeuTyrLeuCysCysGlyIleThrLeuLeuVal145150155160ValIleLeuAlaLeuLeuCysSerIleThrTyrGluSerThrGlyArg165170175GlyIleArgArgCysGlySer180288PRT人工序列合成构建物2MetSerTrpAlaLeuGluMetAlaAspThrPheLeuAspThrMetArg151015ValGlyProArgThrTyrAlaAspValArgAspGluIleAsnLysArg202530GlyArgGluAspArgGluAlaAlaArgThrAlaValHisAspProGlu354045ArgProLeuLeuArgSerProGlyLeuLeuProGluIleAlaProAsn505560AlaSerLeuGlyValAlaHisArgArgThrGlyGlyThrValThrAsp65707580SerProArgAsnProValThrArg85396PRT人工序列合成构建物3MetProArgSerProLeuIleValAlaValValAlaAlaAlaLeuPhe151015AlaIleValArgGlyArgAspProLeuLeuAspAlaMetArgArgGlu202530GlyAlaMetAspPheTrpSerAlaGlyCysTyrAlaArgGlyValPro354045LeuSerGluProProGlnAlaLeuValValPheTyrValAlaLeuThr505560AlaValMetValAlaValAlaLeuTyrAlaTyrGlyLeuCysPheArg65707580LeuMetGlyAlaSerGlyProAsnLysLysGluSerArgGlyArgGly859095460PRT人工序列合成构建物4MetValHisValLeuGluArgAlaLeuLeuGluGlnGlnSerSerAla151015CysGlyLeuProGlySerSerThrGluThrArgProSerHisProCys202530ProGluAspProAspValSerArgLeuArgLeuLeuLeuValValLeu354045CysValLeuPheGlyLeuLeuCysLeuLeuLeuIle5055605221PRT人工序列合成构建物5MetAsnLysPheSerAsnThrArgIleGlyPheThrCysAlaValMet151015AlaProArgThrLeuIleLeuThrValGlyLeuLeuCysMetArgIle202530ArgSerLeuLeuCysSerProAlaGluThrThrValThrThrAlaAla354045ValThrSerAlaHisGlyProLeuCysProLeuValPheGlnGlyTrp505560AlaTyrAlaValTyrHisGlnGlyAspMetAlaLeuMetThrLeuAsp65707580ValTyrCysCysArgGlnThrSerAsnAsnThrValValAlaPheSer859095HisHisProAlaAspAsnThrLeuLeuIleGluValGlyAsnAsnThr100105110ArgArgHisValAspGlyIleSerCysGlnAspHisPheArgAlaGln115120125HisGlnAspCysProAlaGlnThrValHisValArgGlyValAsnGlu130135140SerAlaPheGlyLeuThrHisLeuGlnSerCysCysLeuAsnGluHis145150155160SerGlnLeuSerGluArgValAlaTyrHisLeuLysLeuArgProAla165170175ThrPheGlyLeuGluThrTrpAlaMetTyrThrValGlyIleLeuAla180185190LeuGlySerPheSerSerPheTyrSerGlnIleAlaArgSerLeuGly195200205ValLeuProAsnAspHisHisTyrAlaLeuLysLysAla2102152206368PRT人工序列合成构建物6MetMetThrMetTrpCysLeuThrLeuPheValLeuTrpMetLeuArg151015ValValGlyMetHisValLeuArgTyrGlyTyrThrGlyIlePheAsp202530AspThrSerHisMetThrLeuThrValValGlyIlePheAspGlyGln354045HisPhePheThrTyrHisValAsnSerSerAspLysAlaSerSerArg505560AlaAsnGlyThrIleSerTrpMetAlaAsnValSerAlaAlaTyrPro65707580ThrTyrLeuAspGlyGluArgAlaLysGlyAspLeuIlePheAsnGln859095ThrGluGlnAsnLeuLeuGluLeuGluIleAlaLeuGlyTyrArgSer100105110GlnSerValLeuThrTrpThrHisGluCysAsnThrThrGluAsnGly115120125SerPheValAlaGlyTyrGluGlyPheGlyTrpAspGlyGluThrLeu130135140MetGluLeuLysAspAsnLeuThrLeuTrpThrGlyProAsnTyrGlu145150155160IleSerTrpLeuLysGlnAsnLysThrTyrIleAspGlyLysIleLys165170175AsnIleSerGluGlyAspThrThrIleGlnArgAsnTyrLeuLysGly180185190AsnCysThrGlnTrpSerValIleTyrSerGlyPheGlnThrProVal195200205ThrHisProValValLysGlyGlyValArgAsnGlnAsnAspAsnArg210215220AlaGluAlaPheCysThrSerTyrGlyPhePheProGlyGluIleAsn225230235240IleThrPheIleHisTyrGlyAsnLysAlaProAspAspSerGluPro245250255GlnCysAsnProLeuLeuProThrPheAspGlyThrPheHisGlnGly260265270CysTyrValAlaIlePheCysAsnGlnAsnTyrThrCysArgValThr275280285HisGlyAsnTrpThrValGluIleProIleSerValThrSerProAsp290295300AspSerSerSerGlyGluValProAspHisProThrAlaAsnLysArg305310315320TyrAsnThrMetThrIleSerSerValLeuLeuAlaLeuLeuLeuCys325330335AlaLeuLeuPheAlaPheLeuHisTyrPheThrThrLeuLysGlnTyr340345350LeuArgAsnLeuAlaPheAlaTrpArgTyrArgLysValArgSerSer3553603657338PRT人工序列合成构建物7MetValValMetAlaProArgThrLeuPheLeuLeuLeuSerGlyAla151015LeuThrLeuThrGluThrTrpAlaGlySerHisSerMetArgTyrPhe202530SerAlaAlaValSerArgProGlyArgGlyGluProArgPheIleAla354045MetGlyTyrValAspAspThrGlnPheValArgPheAspSerAspSer505560AlaCysProArgMetGluProArgAlaProTrpValGluGlnGluGly65707580ProGluTyrTrpGluGluGluThrArgAsnThrLysAlaHisAlaGln859095ThrAspArgMetAsnLeuGlnThrLeuArgGlyTyrTyrAsnGlnSer100105110GluAlaSerSerHisThrLeuGlnTrpMetIleGlyCysAspLeuGly115120125SerAspGlyArgLeuLeuArgGlyTyrGluGlnTyrAlaTyrAspGly130135140LysAspTyrLeuAlaLeuAsnGluAspLeuArgSerTrpThrAlaAla145150155160AspThrAlaAlaGlnIleSerLysArgLysCysGluAlaAlaAsnVal165170175AlaGluGlnArgArgAlaTyrLeuGluGlyThrCysValGluTrpLeu180185190HisArgTyrLeuGluAsnGlyLysGluMetLeuGlnArgAlaAspPro195200205ProLysThrHisValThrHisHisProValPheAspTyrGluAlaThr210215220LeuArgCysTrpAlaLeuGlyPheTyrProAlaGluIleIleLeuThr225230235240TrpGlnArgAspGlyGluAspGlnThrGlnAspValGluLeuValGlu245250255ThrArgProAlaGlyAspGlyThrPheGlnLysTrpAlaAlaValVal260265270ValProSerGlyGluGluGlnArgTyrThrCysHisValGlnHisGlu275280285GlyLeuProGluProLeuMetLeuArgTrpLysGlnSerSerLeuPro290295300ThrIleProIleMetGlyIleValAlaGlyLeuValValLeuAlaAla305310315320ValValThrGlyAlaAlaValAlaAlaValLeuTrpArgLysLysSer325330335SerAsp8358PRT人工序列合成构建物8MetValAspGlyThrLeuLeuLeuLeuLeuSerGluAlaLeuAlaLeu151015ThrGlnThrTrpAlaGlySerHisSerLeuLysTyrPheHisThrSer202530ValSerArgProGlyArgGlyGluProArgPheIleSerValGlyTyr354045ValAspAspThrGlnPheValArgPheAspAsnAspAlaAlaSerPro505560ArgMetValProArgAlaProTrpMetGluGlnGluGlySerGluTyr65707580TrpAspArgGluThrArgSerAlaArgAspThrAlaGlnIlePheArg859095ValAsnLeuArgThrLeuArgGlyTyrTyrAsnGlnSerGluAlaGly100105110SerHisThrLeuGlnTrpMetHisGlyCysGluLeuGlyProAspGly115120125ArgPheLeuArgGlyTyrGluGlnPheAlaTyrAspGlyLysAspTyr130135140LeuThrLeuAsnGluAspLeuArgSerTrpThrAlaValAspThrAla145150155160AlaGlnIleSerGluGlnLysSerAsnAspAlaSerGluAlaGluHis165170175GlnArgAlaTyrLeuGluAspThrCysValGluTrpLeuHisLysTyr180185190LeuGluLysGlyLysGluThrLeuLeuHisLeuGluProProLysThr195200205HisValThrHisHisProIleSerAspHisGluAlaThrLeuArgCys210215220TrpAlaLeuGlyPheTyrProAlaGluIleThrLeuThrTrpGlnGln225230235240AspGlyGluGlyHisThrGlnAspThrGluLeuValGluThrArgPro245250255AlaGlyAspGlyThrPheGlnLysTrpAlaAlaValValValProSer260265270GlyGluGluGlnArgTyrThrCysHisValGlnHisGluGlyLeuPro275280285GluProValThrLeuArgTrpLysProAlaSerGlnProThrIlePro290295300IleValGlyIleIleAlaGlyLeuValLeuLeuGlySerValValSer305310315320GlyAlaValValAlaAlaValIleTrpArgLysLysSerSerGlyGly325330335LysGlyGlySerTyrSerLysAlaGluTrpSerAspSerAlaGlnGly340345350SerGluSerHisSerLeu3559112PRT人工序列合成构建物9ArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr202530AspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys354045ProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLys505560AspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArg65707580ArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAla859095ThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg10010511010112PRT人工序列合成构建物10ArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuPheAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluPhe202530AspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys354045ProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLys505560AspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArg65707580ArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAla859095ThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg10010511011112PRT人工序列合成构建物11ArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuPheAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluPhe202530AspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys354045ProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuPheAsnGluLeuGlnLys505560AspLysMetAlaGluAlaPheSerGluIleGlyMetLysGlyGluArg65707580ArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAla859095ThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg10010511012112PRT人工序列合成构建物12ArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly151015GlnAsnGlnLeuPheAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluPhe202530AspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys354045ProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLys505560AspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArg65707580ArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuPheGlnGlyLeuSerThrAla859095ThrLysAspThrPheAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg100105110

权利要求：1.一种分离的T淋巴细胞,其由于降低的或消除的CD3ζ,T细胞受体α链TRAC,和或T细胞受体β链TRBC基因的表达,经过修饰而具有降低的或消除的T细胞受体TCR的表达。2.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因,调节序列,编码序列,外显子,或其一部分突变,导致降低的,缺无的,或非功能性的CD3ζzeta,泽塔,CD3ηeta,伊塔,CD3θtheta,西塔,TRAC,和或TRBC表达的基因组。3.权利要求2的分离的T淋巴细胞,其中该突变是删除和或移码突变。4.权利要求2的分离的T淋巴细胞,其中该突变破坏T细胞受体的装配或CD3ζ信号传导。5.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因删除的基因组。6.权利要求5的分离的T淋巴细胞,其包含其中CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的两个等位基因删除的基因组。7.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其中该降低的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因的表达是缺无的表达。8.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其具有降低的CD3η或CD3θ的表达。9.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其中一个HLA基因座或其一部分是删除的。10.权利要求9的分离的T淋巴细胞,其中该HLA基因座是在染色体6上的。11.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其进一步具有降低的HLAI类表达。12.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其中该分离的T淋巴细胞经过进一步修饰而表达HLA-G。13.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其进一步包含编码推动T淋巴细胞规避来自对其施用该T淋巴细胞的宿主的免疫攻击的异源蛋白的基因。14.权利要求13的分离的T淋巴细胞,其中该异源蛋白推动规避T细胞或NK介导的排斥。15.权利要求13的分离的T淋巴细胞,其中该异源蛋白是病毒蛋白。16.权利要求15的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白来自选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒。17.权利要求16的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。18.权利要求16的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP。19.权利要求18的分离的T淋巴细胞,其中该病毒蛋白选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。20.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其进一步包含编码报告基因的基因。21.权利要求20的分离的T淋巴细胞,其中该报告基因包含截短的表皮生长因子受体EGFR基因,截短的前列腺特异性膜抗原PSMA,截短的低亲和力神经生长因子受体LNGFR,截短的CD19。22.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其进一步包含编码治疗性蛋白的基因。23.权利要求22的分离的T淋巴细胞,其中该治疗性蛋白包含抗原受体。24.权利要求23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体赋予对选定靶抗原的特异性。25.权利要求23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体赋予对选定配体的特异性。26.权利要求23的分离的T淋巴细胞,其中该抗原受体是嵌合抗原受体CAR。27.权利要求26的分离的T淋巴细胞,其中该CAR包含胞外结构域,跨膜区结构域,和胞内区结构域。28.权利要求27的分离的T淋巴细胞,其中该胞外结构域包含单链抗体且该胞内结构域包含T细胞活化域。29.权利要求1的分离的T淋巴细胞,其进一步包含诱导细胞死亡的基因。30.权利要求29的分离的T淋巴细胞,其中该基因是可活化的自杀基因。31.权利要求30的分离的T淋巴细胞,其中该自杀基因是由药物活化的。32.权利要求31的分离的T淋巴细胞,其中该自杀基因表达与胱天蛋白酶9促凋亡分子融合的FK506结合域。33.一种用于生成经修饰的T淋巴细胞的方法,该方法包含灭活T淋巴细胞中的CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因。34.权利要求33的方法,其中该灭活CD3ζ,TRAC,和或TRBC基因是使用选自锌指核酸酶ZFN,转录活化物样效应器核酸酶TALEN,和聚簇规则间隔短回文重复CRISPRcas9系统的组的核酸酶或系统进行的。35.权利要求33的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞是权利要求1的经修饰的T淋巴细胞。36.一种针对疾病治疗受试者的方法,该方法包含对该受试者施用权利要求1的分离的T淋巴细胞。37.权利要求36的方法,其中该疾病选自由癌症,传染病,和移植规程导致的适应症组成的组。38.一种降低受试者中的免疫原性反应的方法,该方法包含对受试者施用权利要求1的T淋巴细胞。39.权利要求38的方法,其中该T淋巴细胞表达转基因。40.权利要求38的方法,其中该T淋巴细胞具有降低的与内源T细胞受体信号传导分子的竞争。41.权利要求36的方法,其中该T淋巴细胞就该受试者而言是自体的。42.权利要求36的方法,其中该T淋巴细胞就该受试者而言是同种异体的。43.权利要求36的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在体内扩充。44.权利要求36的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在该受试者的血液中扩充。45.权利要求36的方法,其中该经修饰的T淋巴细胞在施用前,在体外扩充。46.一种载体,其包含编码治疗性蛋白和推动免疫系统规避的异源蛋白的基因。47.权利要求46的载体,其中该异源蛋白是病毒蛋白。48.权利要求47的载体,其中该病毒蛋白来自选自由巨细胞病毒CMV,埃巴二氏病毒EBV,单纯疱疹病毒HSV,和牛疱疹病毒-1BoHV-1组成的组的病毒。49.权利要求48的载体,其中该病毒蛋白来自CMV且选自由US6,UL40,和UL18组成的组。50.权利要求48的载体,其中该病毒蛋白抑制与抗原加工有关的转运蛋白TAP。51.权利要求50的载体,其中该病毒蛋白选自由CMVUS6,HSVICP47,BoHV-1UL49.5,和EBVBNLF2a组成的组。52.权利要求46的载体,其中该治疗性蛋白是CAR。53.一种用权利要求46的载体转导T淋巴细胞的方法。54.依照权利要求33的方法生成的经修饰的T淋巴细胞或细胞系,或其传代培养物。55.一种药学组合物,其包含至少一种权利要求1的经修饰的T淋巴细胞。56.一种治疗受试者的方法,其包含下述步骤:a依照权利要求33的方法制备经修饰的T淋巴细胞的群体,和b将该经修饰的T淋巴细胞施用于该受试者。57.权利要求56的方法,其中该T淋巴细胞源自要治疗的受试者。58.权利要求56的方法,其中该T淋巴细胞源自健康供体。

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