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申请/专利权人：山东省大健康精准医疗产业技术研究院

摘要：本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其制备方法与应用。包括：1构建重组中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原；2获取中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原单体和二聚体；3小鼠免疫；4构建噬菌体单链抗体库；5富集与筛选。发明利用抗体基因工程技术和噬菌体展示技术构建噬菌体单链抗体库，从中筛选出中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的ScFv，具有高特异性、敏感性，可以特异性识别中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体抗原，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测，为后期建立中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的免疫学快速检测提供理论依据和物质基础。

主权项：1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：1人工合成中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白的核苷酸序列，并将其插入至表达载体pET-DsbA中，得到重组质粒pET-Dsba-NGAL；将重组质粒pET-Dsba-NGAL转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；培养重组大肠杆菌，收集菌体，经分离纯化后，得到重组中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原；2将步骤1所得重组中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原加入至二硫苏糖醇水溶液中，在4℃下过夜反应12～16h，得到中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原单体；将步骤1所得重组中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原加入至二甲基亚砜水溶液中，在4℃下过夜反应12～16h，得到中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原二聚体；3使用步骤2所得中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原单体与中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原二聚体分别对小鼠进行免疫，测定小鼠血清抗体效价，取效价较高小鼠的脾脏；4提取步骤3所得小鼠脾脏RNA，并进行反转录，得到cDNA；然后以cDNA作模板，进行PCR扩增，得到中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白的重链可变区基因和轻链可变区基因；将中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白的重链可变区基因和轻链可变区基因连接，得到中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白的单链抗体基因；将单链抗体基因连接至质粒pCANTAB5E，得到重组质粒pCANTAB5E-scFv；将重组质粒pCANTAB5E-scFv转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；培养重组大肠杆菌，收集菌液；向菌液中添加辅助噬菌体，继续培养，经分离纯化后，得到噬菌体单链抗体库；5采用步骤1所得重组中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白抗原对步骤4所得噬菌体单链抗体库进行富集与筛选，得到中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白单体单链抗体M1、M2与中性粒明胶酶相关脂质运载蛋白二聚体单链抗体D1、D2。

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