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申请/专利权人：福州大学

摘要：本发明提供了一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，具体步骤为：S1.选择STEAP3、SDC4以及NadB基因在细胞内过表达；S2.设计和制备慢病毒过表达质粒；S3.制备和浓缩病毒颗粒；S4.病毒液侵染RAW264.7细胞、NIH‑3T3细胞以及Hacat细胞并筛选出阳性细胞；S5.稳定转染后阳性细胞外泌体分泌量的测定。本发明首次使用慢病毒转染技术在RAW264.7细胞、NIH‑3T3细胞和Hacat细胞中表达STEAP3、SDC4以及NadB基因，具有分泌更多外泌体的功能，为烧伤、创面、创伤、手术、美容等皮肤创面修复和研究提供更多的外泌体材料和途径。

主权项：1.一种基于慢病毒构建多顺反子过表达载体提高外泌体产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.选择STEAP3、SDC4以及NadB基因在细胞内过表达：通过NCBI确定STEAP3、SDC4和NadB基因的CDS序列，通过2A连接肽进行连接；S2.设计和制备慢病毒过表达质粒：以LO2肝细胞的cDNA和商业化质粒为模版，用普通PCR技术和搭桥PCR技术扩增出带有2A连接肽序列的STEAP3、SDC4和NadB三个目的基因片段，并通过无缝克隆技术将目的基因片段与慢病毒载体相连接，获得含有三个目的基因的多顺反子慢病毒表达载体；S3.制备和浓缩病毒颗粒：采用四质粒包装系统，大提三个辅助质粒和含有目的基因的转移质粒，以293T细胞为工程细胞用于包装含有过表达STEAP3、SDC4和NadB基因功能的病毒颗粒，并通过超高速离心机浓缩病毒颗粒；S4.病毒液侵染RAW264.7细胞、NIH-3T3细胞以及Hacat细胞并筛选出阳性细胞：针对三种细胞设置不同的嘌呤霉素浓度梯度，选择48h能杀死90％以上细胞的最低嘌呤霉素浓度；含有感染目的基因的病毒颗粒侵染RAW264.7细胞、NIH-3T3细胞以及Hacat细胞后，用嘌呤霉素浓度进行筛选三轮，倒置荧光显微镜拍摄每轮荧光表达情况，并分别提取第5代细胞的RNA，用试剂盒进行逆转录成cDNA后，以cDNA为模版，通过普通PCR技术对三个目的基因进行鉴定，筛选出阳性细胞；S5.稳定转染后阳性细胞外泌体分泌量的测定：利用瞬时转染技术在外泌体特异性蛋白CD63上标记Nluc荧光素酶，通过荧光素酶检测试剂检测荧光值，NTA测定外泌体的数量和粒径，测定转染三个目的基因的细胞与转染空载质粒细胞的外泌体分泌量。

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