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申请/专利权人：云南农业大学

摘要：本发明涉及微生物及植物病理学领域，具体公开了一种植物病原卵菌游动孢子的计数方法。本发明通过设置相机成相参数，可以清晰的观察到游动孢子一蓝一橙两个形态特征，进而实现游动孢子的计数。本发明能够同时对游动孢子和休止孢进行计数，便于卵菌游动孢子相关实验的进行，提高实验结果的准确性和精确性。本发明所述方法简单可靠，所有带成像设备的显微镜都可适用与本发明所述方法，以实现卵菌游动孢子的计数，从而为植物病害发生严重程度以及杀菌剂药效评价提供一个评价指标。

主权项：1.一种辣椒疫霉菌游动孢子的计数方法，其特征在于，采集待测辣椒疫霉菌，使用无菌水配制成游动孢子悬浮液；吸取50μL悬浮液滴到凹玻片的凹槽中，将其置于显微镜的载物台上，用4倍物镜找到游动孢子，用10倍物镜进行观察;使用明美MC50显微镜照相机进行拍照，设置显微镜照相机参数如下：基本控制：饱和度：98；增益：137；曝光时间：自动；分辨率：2560×1944；颜色校正：OFF；染色：OFF；帧速：NORMALSPEED；曝光控制：自动曝光；颜色控制：增益控制：红色增益：100-120；绿色增益：50-60；蓝色增益：90-100；亮度：0-150；对比度：220-255；伽马值：0.270-0.290；通过计数蓝色或橙色孢子来统计游动孢子数量，通过计数黑色孢子来统计休止孢数量。

全文数据：一种植物病原卵菌游动孢子的计数方法技术领域本发明涉及微生物及植物病理学领域，具体地说，涉及一种植物病原卵菌游动孢子的计数方法统计方法。背景技术植物病原卵菌通过释放具有鞭毛的游动孢子到土壤水中，并在寄主根系分泌物的吸引下向新的寄主植物游动，继而停止形成休止孢，并萌发产生芽管，从而侵染植物。由于植物病原卵菌具有亲水的特性，游动孢子成为卵菌侵染植物的重要媒介，鉴于此，卵菌游动孢子的数量成为植物病害发生严重程度以及杀菌剂使用效果评价的一个重要指标，然而，游动孢子具有较强的移动能力，因此，如何对水中的卵菌游动孢子进行计数，获得游动孢子与休止孢的比例，是卵菌研究中一个亟待解决的技术难题。由于具有鞭毛，游动孢子在水中具有很强的游动性，肉眼要想在显微镜下观察液滴中游动孢子的游动情况并计数是很困难的。现有的孢子计数方法大都是统计非游动孢子或休止孢的，而对于游动孢子的计数方法则比较少。公开号为CN103063491A的中国专利公开了采用载玻片为收集载体的便携式、固定式或移动式孢子捕捉仪，或采用连续式孢子自动捕捉仪。然而，该发明存在以下一些不足：1仅适用于捕捉空气中的孢子或花粉，无法应用于水中或土壤中的孢子，使用范围比较局限。2无法进行孢子的精确计数。公开号为CN103820523A的中国专利申请公开了一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的方法，将土壤制成悬浮液，将不含任何已知抗病基因的感病大豆品种‘Sloan’的叶碟漂浮在液面上，诱捕其中的大豆疫霉菌游动孢子，依据叶碟边缘诱捕到的大豆疫霉菌游动孢子数量，代入公式进行计算。然而，该发明存在以下两个问题：1对于操作时间有较高的要求。若操作时间较长，则游动孢子鞭毛脱落形成无移动能力的休止孢，对于叶碟吸引游动孢子的过程将会造成较大的干扰，从而影响结果的准确性。2该方法需要提前准备寄主植物并制备叶碟，操作过程较为繁琐，且通用性不高，对于大豆品种的要求比较苛刻。植物卵菌游动孢子的释放、游动、萌发是病菌完成侵染的关键，也是病害发生最重要的阶段和病害防治的关键时期。目前很多研究都聚焦于植物组织提取物或化学药剂对卵菌游动孢子游动过程的抑制作用，从而寻找对于植物病原卵菌的防控手段，然而，由于卵菌游动孢子具有快速游动的特点，目前在显微镜下观测卵菌游动孢子的数量都是采用估测的方法，很难精确统计植物组织提取物或化学药剂处理疫霉菌游动孢子悬浮液后游动孢子与休止孢的比例，使得化学物质对于卵菌游动孢子游动过程的抑制实验无法精确定量。因此，亟需提供一种准确性高、精确性高，且通用性强的植物病原卵菌游动孢子的记数方法。发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物病原卵菌游动孢子的记数方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供一种植物病原卵菌游动孢子的记数方法，将待测样品悬浮液，在显微镜观察下，使用显微镜照相机进行拍照，设置显微镜照相机参数如下：基本控制：饱和度：50-100；增益：100-500；曝光时间：自动；分辨率：640×480，1024×768，1280×960，2560×1944；颜色校正：OFF；染色：OFF；帧速：NORMALSPEED或HIGHSPEED均可；曝光控制：自动曝光；颜色控制：增益控制：红色增益：100-120；绿色增益：50-60；蓝色增益：90-100；亮度：0-150；对比度：220-255；伽马值：0.270-0.290；通过计数蓝色或橙色孢子来统计游动孢子数量，通过计数黑色孢子来统计休止孢数量。作为优选，将悬浮液滴到凹玻片的凹槽中，然后将其置于显微镜的载物台上，用4倍物镜找到游动孢子，用10倍物镜进行观察。进一步优选，吸取50μL悬浮液滴到凹玻片的凹槽中。需要说明的是，本发明所使用的显微镜照相机和显微镜可选用所有市售可得的显微镜照相机和所有带成像设备的显微镜。在本发明的具体实施方式中，本发明选用的显微镜照相机型号为明美MC50，显微镜为奥林巴斯BX43。相片中游动孢子数量的统计方法。通过相应参数设置的相机拍摄后，每一个游动孢子在相片中会呈现出蓝色和橙色的孢子形态各一个，而休止孢在相片中则表现为黑色的孢子形态。利用计算机中的“画图”软件进行计数。针对游动孢子和休止孢的成相特征，可以通过计数蓝色或橙色孢子来统计游动孢子数量，通过计数黑色孢子来统计休止孢数量。本发明通过设置相机成相参数，可以清晰的观察到游动孢子一蓝一橙两个形态特征，进而实现游动孢子的计数。第二方面，本发明提供了前述方法在判断化合物对植物病原卵菌游动孢子抑制作用中的应用。所述应用具体为，配制已知浓度的游动孢子悬浮液，利用本发明所述方法对使用化合物干预前后的悬浮液中的游动孢子数量进行统计，判断化合物对植物病原卵菌游动孢子的抑制作用。第三方面，本发明提供了前述方法在检测植物病原卵菌游动孢子中的应用。所述应用具体为，采集待测植物病原卵菌，使用无菌水配制成游动孢子悬浮液。所述待测样品可以是土壤中、植物叶片上的卵菌，也可以是培养基上培养的卵菌。本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明能够同时对游动孢子和休止孢进行计数，便于卵菌游动孢子相关实验的进行，提高实验结果的准确性和精确性。本发明所述方法简单可靠，所有带成像设备的显微镜都可适用与本发明所述方法，以实现卵菌游动孢子的计数，从而为植物病害发生严重程度以及杀菌剂药效评价提供一个评价指标。附图说明图1为本发明载玻片游动孢子悬浮液观察示意图。图2为本发明对照-游动孢子相片左及计数右图3为本发明1000ppm-游动孢子相片左及计数右具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1为了验证本发明所述记数方法的准确性，本实施例使用已知浓度的辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液进行验证试验。具体方法如下：①配制辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液，浓度为2×105个ml。②用移液器吸取40μL游动孢子悬浮液至凹玻片的凹槽中，分别加入6种不同浓度的二烯丙基三硫醚水溶液10μL，使二烯丙基三硫醚终浓度分别为0ppm、10ppm、50ppm、100ppm、500ppm、1000ppm。将凹玻片置于显微镜的载物台上，用4倍物镜找到游动孢子，用10倍物镜进行观察。③打开显微镜的照相软件，设置相机参数如下：显微镜照相机型号：明美MC50；显微镜：奥林巴斯BX43基本控制：饱和度：98；增益：137；曝光时间：自动；分辨率：2560×1944；颜色校正：OFF；染色：OFF；帧速：NORMALSPEED；曝光控制：自动曝光；颜色控制：增益控制：红色增益：110；绿色增益：50；蓝色增益：100；亮度：100；对比度：230；伽马值：0.280；④通过针尖确定游动孢子悬浮液中间层次见图1，在10倍物镜下进行拍照，在同一凹槽中拍摄3个视野，作为3次重复。⑤对拍摄的照片中的游动孢子和休止孢进行统计计数，统计相片中黄色形态为游动孢子，黑色形态为休止孢。通过画图软件进行简单计数，黄色孢子用绿色线条标记，黑色孢子用红色线条标记。当使用的二烯丙基三硫醚终浓度为0ppm时，拍摄的照片如图2所示，可见未经二烯丙基三硫醚处理下，游动孢子为55个，休止孢为0个。当使用的二烯丙基三硫醚终浓度为1000ppm时，拍摄的照片如图3所示，可见在1000ppm二烯丙基三硫醚处理下，游动孢子为0个，休止孢为4个。⑥统计加入二烯丙基三硫醚40min后游动孢子的停止率，并计算停止率均值。停止率＝休止孢数量休止孢数量+游动孢子数量。表1游动孢子在二烯丙基三硫醚作用下的停止情况根据表1中的停止率，计算游动孢子平均停止率，即得表2。表2游动孢子平均停止率⑦通过以上试验，说明二烯丙基三硫醚在10ppm浓度时可以对辣椒疫霉菌游动孢子的游动产生影响，在100ppm浓度时可以对辣椒疫霉菌游动孢子的游动完全抑制。应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种植物病原卵菌游动孢子的计数方法，其特征在于，将待测样品悬浮液，在显微镜观察下，使用显微镜照相机进行拍照，设置显微镜照相机参数如下：基本控制：饱和度：50-100；增益：100-500；曝光时间：自动；分辨率：640×480，1024×768，1280×960，2560×1944；颜色校正：OFF；染色：OFF；帧速：NORMALSPEED或HIGHSPEED均可；曝光控制：自动曝光；颜色控制：增益控制：红色增益：100-120；绿色增益：50-60；蓝色增益：90-100；亮度：0-150；对比度：220-255；伽马值：0.270-0.290；通过计数蓝色或橙色孢子来统计游动孢子数量，通过计数黑色孢子来统计休止孢数量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将悬浮液滴到凹玻片的凹槽中，然后将其置于显微镜的载物台上，用4倍物镜找到游动孢子，用10倍物镜进行观察。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，吸取50μL悬浮液滴到凹玻片的凹槽中。4.权利要求1～3任一项所述的方法在判断化合物对植物病原卵菌游动孢子抑制作用中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，配制已知浓度的游动孢子悬浮液，利用权利要求1～3任一项所述的方法对使用化合物干预前后的悬浮液中的游动孢子数量进行统计，判断化合物对植物病原卵菌游动孢子的抑制作用。6.权利要求1～3任一项所述的方法在检测植物病原卵菌游动孢子中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采集待测植物病原卵菌，使用无菌水配制成游动孢子悬浮液。

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