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申请/专利权人：广州市金圻睿生物科技有限责任公司

摘要：本发明涉及一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR检测方法。具体涉及在实时荧光定量PCR中提供采集和分离信号的方法实现在单个荧光通道进行多重PCR，并提供用于确定Ct和结果判定的数学分析算法，在单通道双靶标PCR中得到的两条扩增曲线的Ct和单通道单靶标PCR得到的扩增曲线的Ct基本一致，表明本发明单通道双靶标PCR方法能够代替两种单通道单靶标PCR，且能避免熔解曲线法的升温操作和额外的结果分析，实现提高多重PCR检测的灵敏性、特异性和检测通量。

主权项：1.一种多温度单荧光通道多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样本中核酸为模板，利用引物探针组合进行实时荧光定量PCR，在PCR循环的较低温度阶段和较高温度阶段采集荧光信号，进行信号分离和数据分析；所述信号分离和数据分析的方法包括：计算靶标2的产物扩增信号子集data扩靶标2：data扩靶标2＝data原靶标2-Fn背靶标2公式1；data原靶标2为较高温度阶段所有扩增循环信号值集合，Fn背靶标2为对基线区域进行最小二乘线性拟合的信号值集合 所述基线区域为1～开始出现指数扩增的循环-1，其中开始出现指数扩增的循环数通过求原始Ct的算法过程得到，确定原始Ct的方法包括：从第i个循环起，把前i个循环作为选定区域，计算选定区域的荧光信号标准差作为以i循环为末端的选定区域的荧光信号标准差SDi靶标2；i从3开始，逐次加1递增，若i递增过程公式3成立，则记录COE，i；在公式3成立的所有COE，i中，最大COE对应的i为扩增曲线的原始Ct，当COE系数为最小的倍数10时，此时对应的i为开始出现指数扩增的循环数，[1～i-1]则作为基线区域； 计算靶标1的产物扩增信号子集data扩靶标1：data修正综合＝k×data扩综合公式4；data扩靶标1＝data修正综合-data扩靶标2公式5；data扩综合为较低温度阶段所有扩增循环信号值集合，k为较低检测温度和较高检测温度的1～10个循环的信号值的平均值的比值，data修正综合为修正后较低温度阶段所有扩增循环信号值集合；根据每个孔位和每个荧光检测通道的data扩靶标2和data扩靶标1，按公式6计算整体扩增数据集dataset扩，j表示第j个孔位，t表示第t个通道，j，t为正整数，n表示样板孔位总量，r表示荧光通道总量； 按公式7在数据集dataset扩中对每一通道的靶标1和靶标2数据子集进行s型曲线拟合校正，Rmax为数据子集中的最大荧光值，x为循环数，x12为扩增荧光值达到Rmax的一半时的循环数，c为荧光增加值的斜率因子； 计算数据子集datajt扩靶标1和datajt扩靶标2的Ct值Ctjt扩靶标1和Ctjt扩靶标2，由公式7计算Ct下的荧光信号值和由公式8计算总体阈值为YCt靶标1和YCt靶标2，若和分别大于等于YCt靶标1和YCt靶标2，则说明第j孔位和第t通道的扩增曲线在靶标1和靶标2检测均是阳性的，否则若小于则说明是阴性的；

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