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申请/专利权人：北京林业大学

摘要：本发明公开了一种适用于原子力显微镜检测植物细胞质膜损伤程度的方法，包含以下步骤：步骤1、制备拟南芥原生质体；步骤2、将原生质体过滤后100g离10min，去除上清液，加入W5洗涤液洗脱两次；步骤3、将洗脱后的原生质体分成两份，一份直接加入4％的戊二醛进行过夜固定，另外一份加入10mM的MβCD进行处理，处理15min后，立即用W5洗涤液进行洗脱，洗脱两次后加入4％的戊二醛进行过夜固定；步骤4、将固定后的原生质体，用蒸馏水洗脱两次后，滴加在云母片上，室温下干燥后，即可用AFM扫描成像，本发明提供了造成拟南芥细胞质膜损伤的方法，和可以定量分析其损伤程度的方法。

主权项：1.适用于原子力显微镜检测植物细胞质膜损伤程度的方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1、制备拟南芥原生质体；步骤2、将原生质体过滤后100g离心10min，去除上清液，加入W5洗涤液洗脱两次；步骤3、将洗脱后的原生质体分成两份，一份直接加入4%的戊二醛进行过夜固定，另外一份加入10mM的MβCD进行处理，处理15min后，立即用W5洗涤液进行洗脱，洗脱两次后加入4%的戊二醛进行过夜固定；步骤4、将固定后的原生质体，用蒸馏水洗脱两次后，滴加在云母片上，室温下干燥后，即可用AFM扫描成像，将AFM成像的图片,利用NanoScopeAnalysis软件进行分析，计算其Ra、Rq、Rmax，以及从孔隙周围的长轴和短轴上分别测量每个孔隙的直径和深度，利用Prism分析处理组与未处理组Ra、Rq、Rmax以及每个孔隙的长轴和短轴上的直径和深度的差异性；所述步骤1具体是：将0.5g拟南芥莲座叶剪碎后加入酶解液，45rpmmin，22-24℃避光酶解3h；所述步骤1中，酶解液配方为：CellulaseR-100.15g，MacerozymeR-100.04g，0.8MD-甘露醇5mL，2MKCl100μL，200mMMES·H2O1mL，1MCaCl2·H2O100μL，BSA0.01g，蒸馏水补齐至10mL；所述步骤2中，W5洗涤液配方为：Nacl0.9g，MES·H2O0.03g，KCl0.15g，Glucose0.09g，1MCaCl2·H2O200μL，0.8MD-甘露醇50mL，蒸馏水补齐至100mL；所述步骤2中，采用40μm的一次性细胞过滤器进行过滤；所述洗涤液还需要用KOH调节PH=5.7，并将洗涤液用0.22μm微孔滤膜过滤；所述AFM的型号为BRUKERMULTIMODE8，扫描模式为轻敲模式。

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