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申请/专利权人：东北农业大学

摘要：一种快速分离四种双歧杆菌的方法。本发明提供了一组共包括5对用于分离鉴定两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种四种双歧杆菌的PCR引物及其应用，该应用与方法应当但不限于包含如下步骤，1）通过比较基因组学比较四种双歧杆菌的糖苷水解酶（GH）家族基因，寻找共有和各自特有的糖苷水解酶家族基因；2）针对比对结果设计四种双歧杆菌的共有和特有引物；3）使用目标细菌的菌落或DNA并应用所设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行核酸电泳验证；4）其在目标位置出现双阳性条带，即可证明为上述四种双歧杆菌的一种。通过本发明所提供的引物从复杂样品中分离对应的种属的双歧杆菌，可达到准确、简便、高效且低成本的目的。

主权项：1.一组基于双歧杆菌较强的糖苷水解酶家族基因的设计的四种双歧杆菌的多重PCR引物，其特征在于:对长双歧杆菌长亚种的特异性GH30_5家族基因进行比对对齐，设计长双歧杆菌长亚种的特有引物为loF和loR，使用该引物扩增的PCR序列约为641bp（B.longumsubsp.longumJCM1217）对短双歧杆菌的特异性GH13-44家族基因进行比对对齐，设计短双歧杆菌的特异引物brF和brR，使用该引物扩增的PCR序列约为521bp（B.breveUCC2003）对两歧双歧杆菌的特异性GH30_5家族基因进行比对对齐，设计两歧双歧杆菌的特异引物为biF和biR，使用该引物扩增的PCR序列约为843bp（B.bifidumATCC29521）长双歧杆菌婴儿亚种并没有特异性的糖苷水解酶家族，但是其有两个GH29家族，其中的一个GH29家族基因具有特异性，以该基因进行比对对齐设计长双歧杆菌婴儿亚种的特异引物为inF和inR，使用该引物扩增的PCR序列约为739bp（B.longumsubsp.infantisATCC15697）根据所设计的引物对复杂样品中涂布平板上的菌落进行菌落PCR，使用凝胶电泳对PCR扩增产物进行验证，在特定的位置出现特定的双阳性结果即为所分离的双歧杆菌上述的引物allF和allR分别对应SEQNO.1和SEQNO.2所对应的靶序列对应为SEQNO.3上述的引物loF和loR分别对应SEQNO.4和SEQNO.5所对应的靶序列对应为SEQNO.6上述的引物brF和brR分别对应SEQNO.7和SEQNO.8所对应的靶序列对应为SEQNO.9上述的引物biF和biR分别对应SEQNO.10和SEQNO.11所对应的靶序列对应为SEQNO.12上述的引物inF和inR分别对应SEQNO.13和SEQNO.14所对应的靶序列对应为SEQNO.15。

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权利要求：

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