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申请/专利权人：王欢

摘要：本发明公开了一种CIK细胞激活剂苦蘵内酯A的制备方法。本发明发现，表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A可以激活CIK细胞中颗粒酶B的表达，为有效的颗粒酶B激活剂；颗粒酶B激活剂表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A可以显著提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。本发明还提供了制备表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦蘵内酯A、苦蘵内酯F和魏察苦蘵素A的方法，该方法不依赖于反复柱层析，适用于工业化大规模制备。现有技术没有公开过本发明公开的技术方案。

主权项：1.一种苦蘵内酯A，其特征在于，化学结构式如下：

全文数据：一种CIK细胞激活剂苦藤内酯A的制备方法技术领域[0001]本发明属于生物领域，具体涉及CIK细胞的培养及诱导化合物的制备方法。背景技术[0002]恶性肿瘤严重危害人类健康，目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段。其中，细胞因子诱导的杀伤细胞cytokine-inducedkillercells，CIK细胞是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤免疫治疗领域的一种新选择。CIK是以⑶3+⑶56+T细胞为主的异质细胞群，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点（参考文献:黄招琴等，卡介菌多糖核酸对CIK细胞活性的影响，湖南师范大学自然科学学报，2017年3月第40卷第2期）。[0003]颗粒酶B是杀伤性T淋巴细胞和NK细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，通过Caspases依赖途径、直接入核途径及不依赖Caspases的胞质途径杀伤祀细胞，颗粒酶B的表达水平直接关系到CIK细胞对肿瘤的杀伤力（参考文献：PrakashMD，BirdCH，BirdPI.ActiveandzymogenformsofgranzymeBareconstitutivelyreleasedfromcytotoxiclymphocytesintheabsenceoftargetcellengagement，ImmunolCellBiol.2009〇[0004]因此，如果能寻找到促进CIK细胞颗粒酶B表达水平的诱导化合物，就可以用于CIK细胞培养提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。[0005]表原莪术烯醇CAS登录号127214-97-5、莪术烯醇CAS登录号19431-84-6、苦藤内酯ACAS登录号146713-98-6、苦藤内酯F和魏察苦藤素ACAS登录号120824-03-5的化学信息如图1所示。目前没有现有技术道过表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A可以存进CIK细胞颗粒酶B的表达。[0006]另外，目前制备表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F、魏察苦藤素A的方法步骤复杂，依赖于反复柱层析，不适用于规模化制备。发明内容[0007]本发明的目的在于提供一种CIK细胞的培养方法。[0008]本发明通过下面的技术方案得以实现的：[0009]—种CIK细胞的培养方法，包括：[0010]取外周抗凝血IOOmU加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5XIO6个mL加含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0011]诱导培养7天后，用新的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2X106ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μΜ，刺激培养2d后，换成含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2〜3d半量换液。[0012]所述颗粒酶B激活剂为表原莪术烯醇。[0013]进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。[0014]进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μΜ。[0015]一种CIK细胞的培养方法，包括：[0016]取外周抗凝血IOOmU加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5XIO6个mL加含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0017]诱导培养7天后，用新的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2X106ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μΜ，刺激培养2d后，换成含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2〜3d半量换液。[0018]所述颗粒酶B激活剂为莪术烯醇。[0019]进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。[0020]进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μΜ。[0021]—种CIK细胞的培养方法，包括：[0022]取外周抗凝血IOOmU加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5XIO6个mL加含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0023]诱导培养7天后，用新的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2X106ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μΜ，刺激培养2d后，换成含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2〜3d半量换液。[0024]所述颗粒酶B激活剂为苦藤内酯A。[0025]进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。[0026]进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μΜ。[0027]一种CIK细胞的培养方法，包括：[0028]取外周抗凝血IOOmU加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5XIO6个mL加含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0029]诱导培养7天后，用新的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2X106ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μΜ，刺激培养2d后，换成含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2〜3d半量换液。[0030]所述颗粒酶B激活剂为苦藤内酯F。[0031]进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。[0032]进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μΜ。[0033]一种CIK细胞的培养方法，包括：[0034]取外周抗凝血10OmL，加入淋巴细胞分离液，150Orpm离心15miη，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5XIO6个mL加含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0035]诱导培养7天后，用新的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基调整细胞数为2X106ml，并加入颗粒酶B激活剂至终浓度为4-6μΜ，刺激培养2d后，换成含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基继续培养，每隔2〜3d半量换液。[0036]所述颗粒酶B激活剂为魏察苦藤素A。[0037]进一步地，外周抗凝血取自健康人或肿瘤患者。[0038]进一步地，颗粒酶B激活剂终浓度为5μΜ。[0039]一种表原莪术烯醇，化学结构式如下：[0041]上述表原莪术烯醇的制备方法，包括：[0042]步骤Sl，粗品的制备：[0043]将蓬莪术药材粉碎后，过40目筛，取800g用4L体积百分浓度为75%的乙醇水溶液在400W功率下微波提取20min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于ADS-17大孔吸附树脂柱75cmX3.5cm，树脂450mL，先用5倍柱床体积的45%乙醇洗脱，再用5倍柱床体积的75%乙醇洗脱，收集第4-5倍柱床体积的75%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0044]步骤S2,高速逆流制备分离过程：[0045]配制两相溶剂体系（二氯甲烷异丙醇吡啶水=4215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在225nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图4收集表原莪术烯醇对应的流份，浓缩干燥。[0046]—种莪术烯醇，化学结构式如下：[0048]上述莪术烯醇的制备方法，包括：[0049]步骤Sl，粗品的制备：[0050]将蓬莪术药材粉碎后，过40目筛，取800g用4L体积百分浓度为75%的乙醇水溶液在400W功率下微波提取20min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于ADS-17大孔吸附树脂柱75cmX3.5cm，树脂450mL，先用5倍柱床体积的45%乙醇洗脱，再用5倍柱床体积的75%乙醇洗脱，收集第4-5倍柱床体积的75%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0051]步骤S2,高速逆流制备分离过程：[0052]配制两相溶剂体系（二氯甲烷异丙醇吡啶水=4215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在225nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图4收集莪术烯醇对应的流份，浓缩干燥。[0053]—种苦藤内酯A，化学结构式如下：[0055]上述苦藤内酯A的制备方法，包括：[0056]步骤Sl，粗品的制备：[0057]将苦藤干燥全草粉碎后，过40目筛，取Ikg用5L体积百分浓度为70%的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱90cmX3.5cm，树脂550mL，先用5倍柱床体积的30%乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70%乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0058]步骤S2,高速逆流制备分离过程：[0059]配制两相溶剂体系（正丁醇甲醇乙酸水=6215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在210nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图6收集苦藤内酯A对应的流份，浓缩干燥。[0060]—种苦藤内酯F，化学结构式如下：[0062]上述苦藤内酯F的制备方法，包括：[0063]步骤Sl，粗品的制备：[0064]将苦藤干燥全草粉碎后，过40目筛，取Ikg用5L体积百分浓度为70%的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱90cmX3.5cm，树脂550mL，先用5倍柱床体积的30%乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70%乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0065]步骤S2,高速逆流制备分离过程：[0066]配制两相溶剂体系（正丁醇甲醇乙酸水=6215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在210nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图6收集苦藤内酯F对应的流份，浓缩干燥。[0067]一种魏察苦藤素A，化学结构式如下：[0069]上述魏察苦藤素A的制备方法，包括：[0070]步骤Sl，粗品的制备：[0071]将苦藤干燥全草粉碎后，过40目筛，取Ikg用5L体积百分浓度为70%的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱90cmX3.5cm，树脂550mL，先用5倍柱床体积的30%乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70%乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0072]步骤S2,高速逆流制备分离过程：[0073]配制两相溶剂体系（正丁醇甲醇乙酸水=6215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在210nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图6收集魏察苦藤素A对应的流份，浓缩干燥。[0074]有益效果：[0075]本发明发现，表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A可以激活CIK细胞中颗粒酶B的表达，为有效的颗粒酶B激活剂;颗粒酶B激活剂表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A可以显著提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。本发明还提供了制备表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A的方法，该方法不依赖于反复柱层析，适用于工业化大规模制备。现有技术没有公开过本发明公开的技术方案。附图说明[0076]图1为表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A化学结构式；[0077]图2为表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A对CIK细胞中颗粒酶B表达水平的影响；[0078]图3为表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A对CIK细胞杀瘤活性的影响；[0079]图4为HSCCC分离制备表原莪术烯醇和莪术烯醇的色谱图（溶剂体系为二氯甲烷异丙醇吡啶水=4215;[0080]图5为HSCCC分离制备表原莪术烯醇和莪术烯醇的色谱图（溶剂体系为二氯甲烷异丙醇四氢呋喃水=4215;[0081]图6为HSCCC分离制备苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A的色谱图（溶剂体系为正丁醇甲醇乙酸水=6215;[0082]图7为HSCCC分离制备苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A的色谱图（溶剂体系为正丁醇甲醇水=625。具体实施方式[0083]下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。[0084]实施例1:表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A对CIK细胞中颗粒酶B表达水平的影响颗粒酶B激活剂）[0085]—、实验材料[0086]淋巴细胞分离液购自佳和生物。[0087]胎牛血清、GT-T551培养基购自美国Gibco公司。[0088]⑶3mAB购自北京同立源生物科技有限公司，IL-2购自江苏金丝利药业有限公司。[0089]二、实验方法[0090]UCIK细胞的分离及诱导培养[0091]取健康志愿者外周抗凝血IOOmU加入淋巴细胞分离液，1500rpm离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次，每次1500rpm离心IOmin;最后一次离心后重悬细胞，按细胞数5\106个!!^加含有50^8100311^8、10001]11^11^-2和10%?85的61^551培养基诱导培养成CIK细胞，每隔2〜3d半量换液。[0092]2、实验分组[0093]实验共分9组，具体包括如下：[0094]空白对照组；[0095]异原莪术烯醇阴性对照组、异莪术烯醇阴性对照组、苦藤内酯C阴性对照组；[0096]表原莪术烯醇干预组、莪术烯醇干预组、苦藤内酯A干预组、苦藤内酯F干预组、魏察苦藤素A干预组。[0097]空白对照组使用含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基培养；阴性对照组和干预组在空白对照组培养基基础上添加5μΜ相应化合物培养。[0098]3、RT-PCR测定颗粒酶BmRNA表达水平[0099]取诱导培养7d的CIK细胞，调整细胞数为2XIO6Ail，铺于24孔板中，24h后弃掉旧培养液，加入新鲜的含有500ygLCD3mAB、1000UmLIL-2和10%FBS的GT-T551培养基，阴性对照组和干预组分别加入相应化合物，继续培养48h。[0100]培养48h后，收集细胞，加入Trizol进行总RNA的提取，取RNA提取液用紫外分光光度计测定A260A280比值，在1.8〜2.0之间则符合要求继续试验。进行RNA反转录，内参采用β-actin，根据GenBank检索目的基因核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0软件设计上下游引物，引物合成委托上海生工生物工程有限公司。颗粒酶B和β-actin的引物序列如下：[0101]颗粒酶B-F:5’-TGCGAGAGAATCGAAGTGGCG-3’；[0102]颗粒酶B-R:5’-CGCCATGCTCTGTTCTGTC-3’；[0103]0-actin-F:5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’；[0104]0-actin-R:5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。[0105]PCR反应Primer10yM0.5yL，PCRH2O13yL，cDNAlyL。每个样本3个复孔，反应条件：95°C10min预变性，95°C15s、60°C60s扩增40个循环，获得各样本待测基因的CT值。PCR结果采用法，计算颗粒酶BmRNA0-actinmRNA相对定量颗粒酶B的表达水平。[0106]4、统计学分析[0107]实验数据采用SPSS19.0统计学软件分析，数据以x±s表示，两组数据比较用t检验，以P0.05;与空白对照组相比，表原莪术烯醇干预组、莪术烯醇干预组、苦藤内酯A干预组、苦藤内酯F干预组、魏察苦藤素A干预组CIK细胞中颗粒酶B的表达水平均显著升高P0.05;与空白对照组相比，表原莪术烯醇干预组、莪术烯醇干预组、苦藤内酯A干预组、苦藤内酯F干预组、魏察苦藤素A干预组CIK细胞杀伤活性显著升高P0.05。[0132]表2对CIK细胞杀伤活性的影响[0133][0134]上述结果表明，颗粒酶B激活剂表原莪术烯醇、莪术烯醇、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A可以显著提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。[0135]实施例3:颗粒酶B激活剂表原莪术烯醇、莪术烯醇的制备[0136]一、仪器和材料[0137]TBE-300A高速逆流色谱仪购于中国上海同田生化技术有限公司。[0138]ADS-17大孔吸附树脂购于购于安徽三星树脂科技有限公司。[0139]二、分离方法和结果[0140]I、表原莪术烯醇和莪术烯醇粗品的制备[0141]将蓬莪术药材粉碎后，过40目筛，取800g用4L体积百分浓度为75%的乙醇水溶液在400W功率下微波提取20min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于ADS-17大孔吸附树脂柱75cmX3.5cm，树脂450mL，先用5倍柱床体积的45%乙醇洗脱，再用5倍柱床体积的75%乙醇洗脱，收集第4-5倍柱床体积的75%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0142]2、高速逆流制备分离过程[0143]配制两相溶剂体系（二氯甲烷异丙醇吡啶水=4215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在225nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图4收集表原莪术烯醇、莪术烯醇对应的流份，浓缩干燥。[0144]制备得到的表原莪术烯醇的HPLC纯度为99.2%，莪术烯醇的HPLC纯度为98.7%。[0145]发明人还尝试了多种溶剂体系，但是分离效果很差，如溶剂体系为二氯甲烷异丙醇四氢呋喃水=4215时的HSCCC分离图谱如图5所示，表原莪术烯醇和莪术烯醇无法分开。[0146]实施例4:颗粒酶B激活剂苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A的制备[0147]一、仪器和材料[0148]TBE-300A高速逆流色谱仪购于中国上海同田生化技术有限公司。[0149]BS-75大孔吸附树脂购于购于安徽三星树脂科技有限公司。[0150]二、分离方法和结果[0151]1、苦藤内酯A、苦藤内酯F和魏察苦藤素A粗品的制备[0152]将苦藤干燥全草粉碎后，过40目筛，取Ikg用5L体积百分浓度为70%的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱90cmX3.5cm，树脂550mL，先用5倍柱床体积的30%乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70%乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。[0153]2、高速逆流制备分离过程[0154]配制两相溶剂体系（正丁醇甲醇乙酸水=6215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以lOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为IOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在210nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图6收集苦藤内酯A、苦藤内酯F、魏察苦藤素A对应的流份，浓缩干燥。[0155]制备得到的苦藤内酯A的HPLC纯度为98.6%，苦藤内酯F的HPLC纯度为99.3%，魏察苦藤素A的HPLC纯度为99.0%。[0156]发明人还尝试了多种溶剂体系，但是分离效果很差，如溶剂体系不添加乙酸时的HSCCC分离图谱如图7所示，苦藤内酯A和魏察苦藤素A无法分开。[0157]上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

权利要求：1.一种苦藤内酯A，其特征在于，化学结构式如下：2.权利要求1所述苦藤内酯A的制备方法，其特征在于包括：步骤SI，粗品的制备：将苦藤干燥全草粉碎后，过40目筛，取Ikg用5L体积百分浓度为70%的乙醇水溶液热回流提取120min，提取2次，合并滤液减压浓缩至无醇味，上样于BS-75大孔吸附树脂柱90cmX3.5cm，树脂550mL，先用5倍柱床体积的30%乙醇洗脱，再用6倍柱床体积的70%乙醇洗脱，收集第5-6倍柱床体积的70%乙醇洗脱液，减压浓缩得粗品，备用。步骤S2，高速逆流制备分离过程：配制两相溶剂体系（正丁醇甲醇乙酸水=6215，充分振摇后静置，使用前分开上下相，超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相，下相溶剂为流动相。将固定相以IOmLmin栗入高速逆流色谱仪的分离柱中，同时开启恒温循环装置使温度保持在25°C，待固定相充满管道后，启动高速逆流色谱仪主机，调整转速为lOOOrpm，使螺旋管顺时针旋转，待达到设定转速IOOOrpm时，以2mLmin的流速栗入流动相。当流动相从分离柱出口流出时，两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡。取上述粗品300mg溶于IOmL上相和IOmL下相组成的溶剂中作为样品溶液，将样品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接，在210nm处进行检测，根据色谱工作站谱图（图6收集苦藤内酯A对应的流份，浓缩干燥。

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