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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明涉及一种GyV8新型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法。该方法是用pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。本发明不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外重组技术克隆GyV8病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

主权项：一种GyV8型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法，其特征在于，利用pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

全文数据：一种GyVS型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种GyVS新型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法。此发明可直接提供VP3可溶性蛋白作为GyV8诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV8血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。背景技术[0002]环形病毒Gyrovirus隶属于环状病毒科环形病毒属是一种小型无囊膜二十面体对称的单股环状DNA病毒，大小超过2KB。鸡传染性贫血病毒ChickenInfectiousAnemiaVirus,CAV一直被认为是圆环病毒科Circoviridae中环形病毒属Gyrovirus唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。2015年，LI等人通过序列非依赖性基因体扩增技术在暴雪鹱组织中发现了GyVS的序列。GyVS属于环形病毒系统发育树第三分支的第一个成员，是第一个来源于其他禽类而非鸡的环形病毒。GyVS基因组为2218bp，（GyV8，GenBank登录号no.KR137527三个重叠的开放阅读框编码VPl478-aa、VP2232-aa、VP3103-aa，与其他环形病毒的同源性很低，仅其VPl片段有38%-42%的同源性。HGyV的VP3具有和CAV的VP3相似的亚细胞分布模式和细胞凋亡的诱导功能，其诱导细胞凋亡的信号通路也已阐明。然目前尚无检测GyVS抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV8病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyVS蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyVS在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂;并为探究GyV8VP3生物学功能具有重要意义。[0003]在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTMII体外重组技术克隆GyV8病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。发明内容[0004]本发明的目的是在于提供一种GyVS型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。[0005]本发明所述的GyV8型环形病毒VP3蛋白的制备方法。是利用pGEX-6p_l线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。[0006]本发明的方法具体包括以下步骤：[0007]1利用下述引物，以pGEX-6p-l质粒为模板，PCR扩增PGEX-6P-1线性化载体；[0008]上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；[0009]下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。[0010]2利用下述引物，以pUC57-AV8VP3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；[0011]上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGTTGCCAGATCTGAC-3’；[0012]下游引物：5’-GITTTCACCGTCATTAAAAAGGGGTCGATT-3’。[0013]3利用重组酶ExnaseTMII对步骤1和2得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3,阳性克隆经IPTG诱导表达，实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。[00M]本发明的方法中，所述PCR扩增的反应体系为：[0015]40μ1水，5μ110倍缓冲液，ΙμΐIOmM1ΝΤΡ，1μ110μΐΉ〇1上游引物，Ιμΐ10μΐΉ〇1下游引物，ΙμΐlOngμΙ的pGEX-6p-l质粒或pUC57-AV8VP3质粒，Ιμΐ商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。[0016]PCR扩增反应循环参数为:95°C变性3分钟，随后进行30个循环，所述循环为95°C变性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3分钟;最后72°C延伸10分钟。[0017]该发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，可快速构建GyVS病毒VP3基因的原核可溶性表达载体。本发明获得的GyV8VP3可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3可溶性蛋白作为GyVS诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyVS流行病学调查提供有效诊断试剂;并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。附图说明[0018]图1一种GyVS新型环形病毒VP3蛋白制备方法策略[0019]步骤1:含GyV8病毒VP3基因的pUC57-AV8VP3为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段。[0020]步骤2:利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。[0021]步骤3:阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白可溶性表达。[0022]步骤4:GyV8病毒VP3可溶性蛋白纯化。[0023]图2PCR扩增GyV8病毒VP3片段[0024]泳道l，GyV8病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNAMarker。[0025]图3PCR扩增线性化载体pGEX-6p-l[0026]泳道1，线性化载体pGEX-6p-l的PCR产物;泳道M，DNAMarker。[0027]图4SDS-PAGE分析GyV8病毒VP3基因的表达[0028]泳道I，VP3超声裂解上清；泳道2，GST超声裂解上清;泳道3，纯化的VP3蛋白；泳道M，蛋白Marker。[0029]图5Westernblot鉴定抗GyV8VP3蛋白多克隆抗体[0030]1，转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。具体实施方式[0031]为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了GyVS新型环形病毒VP3可溶性蛋白制备的不例。[0032]实施例[0033]1设计扩增pGEX-6p-l线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段引物:扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位;且在5’端带有额外TAA碱基;扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位;且在5’端带有额外CAT碱基。扩增GyV8病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有15个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补的额外碱基;扩增GyVS病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有15个与pGEX-6p-l线性化载体上游引物反向互补的额外碱基。具体引物序列见附表1，由金唯智公司合成。[0034]表1.扩增pGEX-6p-l线性化载体和GyV8病毒VP3片段引物设计[0036]2GyVS新型环形病毒VP3蛋白可溶性表达载体构建及蛋白纯化：以商品化的pGEX-6p-l质粒以及含GyV8病毒VP3基因的pUC57-AV8VP3由金唯智公司合成为模版，利用表1中引物，按照图1技术路线，通过PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段;并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白可溶性表达。[0037]pGEX-6p-l线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-l质粒以及AGyV8-VP3质粒为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。[0038]PCR扩增反应体系为:40μ1水，5μ110倍缓冲液，ΙμΐIOmM1ΝΤΡ，1μ1ΙΟμπιοΙ上游引物，ΙμΐIOymol下游引物，ΙμΐlOngμΙ的pGEX-6p-l质粒或pUC57-GyV8VP3质粒，Ιμΐ商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为:95°C变性3分钟，随后进行30个循环95°C变性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，A.1、2、3代表线性化pGEX-6p-1载体PCR扩增产物，M为GENEIKBMARKER;B.GyV8-VP3片段PCR扩增产物，M为IOObpMARKERo[0039]GyV8病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-l载体：将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-l以及GyV8病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组克隆，如图2、3。具体重组反应体系如下：纯化的GyV8病毒VP3片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-l表达线性化载体50ng，2yl商品化的ExnaseTMII酶，4μ15倍的缓冲液，其它补加水至20μ1。反应物于37°C作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μ1反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。[0040]GyV8病毒VP3可溶性蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含GyV8病毒VP3基因的阳性克隆（命名为PGEX-VP3转化BL21细菌，按1:100转接种到含有AMP+的LB培养基中，摇菌3h后，加入IPTGlmm〇lml诱导5h后收集细菌，进行超声40hz，40min破碎。将超声破碎样品离心6000rmin，IOmin后，将超声破碎样品离心后分上清与沉淀进行SDS-PAGE5%的浓缩胶，10%的分离胶鉴定其可溶性表达。在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化，蛋白浓度测定发现纯化后的蛋白浓度为1.0mgml。如图4,可见VP3蛋白在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。泳道3是VP3蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果。[0041]为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原，将纯化的VP3蛋白免疫小鼠，并通过westernblot验证小鼠血清中抗VP3抗体的表达。收集转染pcEGFP-VP3质粒的293T细胞进行裂解，细胞裂解产物进行WB的分析，一抗用小鼠三免后的血清，二抗为羊抗鼠HRP标记的IgG。如图5，小鼠多抗血清能与转染EGFP-VP3的293T细胞中的约为40kD的特异性蛋白条带反应。结果表明本发明表达的VP3蛋白具有很好的反应及免疫原性，在GyVS血清学诊断中将具有良好的应用前景。

权利要求：1.一种GyVS型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法，其特征在于，利用PGEX-6P-1线性化载体以及GyVS病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3,转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，包括以下步骤：1利用下述引物，以pGEX-6p-l质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-l线性化表达载体；上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；下游引物:5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。2利用下述引物，以PUC57-AV8VP3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGTTGCCAGATCTGAC-3’；下游引物：5’-GITTTCACCGTCATTAAAAAGGGGTCGATT-3’。3利用重组酶ExnaseTMII对步骤1和2得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为:40μ1水，5μ110倍缓冲液，ΙμΐIOmM1ΝΤΡ，1μ1ΙΟμπιοΙ上游引物，ΙμΐΙΟμπιοΙ下游引物，ΙμΐlOngμΙ的pGEX_6p_l质粒或pUC57_AV8VP3质粒，Ιμΐ商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应循环参数为:95°C变性3分钟，随后进行30个循环，所述循环为95°C变性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3分钟；最后72°C延伸10分钟。

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