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申请/专利权人：扬州大学

摘要：一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，涉及GyV3新型环形病毒的诊断用融合蛋白的制备技术领域。本发明设计了扩增出pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段的两对引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II，不经酶切连接反应，直接在体外快速重组取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。本发明简化了克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

主权项：一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）以pGEX‑6p‑1质粒为模板，采用下述引物PCR扩增出pGEX‑6p‑1线性化表达载体；上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’；2）以人工合成的GyV3‑VP3 基因为模板，采用下述引物PCR扩增出VP3基因片段；上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’；3）在重组酶ExnaseTM II的作用下，将所述pGEX‑6p‑1线性化表达载体和VP3基因片段进行重组克隆，取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。

全文数据：一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及GyV3新型环形病毒的诊断用融合蛋白的制备技术领域。背景技术[0002] 鸡的传染性贫血病毒CAV—直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，新型人源环形病毒HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96%。自2012年以来，环形病毒属中第三个成员GyV3的DNA序列也在人的粪便、皮肤拭子以及其他动物粪便中相继被发现。[0003]目前尚无检测GyV3抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV3病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV3蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV3在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂;并为探究GyV3VP3生物学功能具有重要意义。[0004] 在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。发明内容[0005] 本发明的目的是在于提供一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，并实现VP3蛋白的表达，可以用于对GyV3在鸡群以及人群中的感染提供明确、有效的诊断。[0006] 本发明技术方案包括以下步骤:1以pGEX-6p-l质粒为模板，采用下述引物PCR扩增出PGEX-6P-1线性化表达载体；上游引物:5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；下游引物:5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’；2以人工合成的GyV3-VP3基因为模板，采用下述引物PCR扩增出VP3基因片段；上游引物:5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；下游引物:5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’；3在重组酶ExnaseTM II的作用下，将所述pGEX_6p_l线性化表达载体和VP3基因片段进行重组克隆，取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。[0007] 本发明上述扩增pGEX-6p-l线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位;且在引物的5‘端带有额外TAA碱基;扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位;且在引物的5‘端带有额外CAT碱基。[0008] 本发明上述扩增GyV3病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在引物的5‘端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补碱基;扩增GyV3病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在引物的5‘端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体上游引物反向互补碱基。[0009] 本发明设计了扩增出pGEX-6p_l线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段的两对引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII，不经酶切连接反应，直接在体外快速重组取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。本发明简化了克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。[0010] 本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，可快速构建GyV3病毒VP3基因的原核表达载体。本发明获得的GyV3病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV3诊断抗原;作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV3流行病学调查提供有效诊断试剂;并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。[0011] 附图表说明图1为本发明GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的构建示意图。[0012]图2为扩增出的pGEX-6p-l线性化载体、扩增出的GyV3病毒VP3基因片段和DNAMarker在1%的琼脂糖凝胶中的电泳图。[0013] 图3为SDS-PAGE分析GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的表达的电泳图。[0014] 图4为Westernblot鉴定抗AGV3VP3蛋白多克隆抗体的电泳图。具体实施方式[0015]结合附图以下实施方式给出了 GyV3新型环形病毒VP3蛋白制备的示例。[0016] 1、设计扩增含如欣-如-丨线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段引物:扩增pGEX-6p-l线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位;且在5’端带有额外TAA碱基;扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位;且在5’端带有额外CAT碱基。[0017] PCR扩增pGEX-6p_l线性化载体引物:上游引物:5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；下游引物:5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’。[0018] 扩增GyV3病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补碱基;扩增GyV3病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX_6p-l线性化载体上游引物反向互补碱基。[0019] PCR扩增GyV3病毒VP3基因引物:上游引物:5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；下游引物:5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’。[0020] 以上两对引物均由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成并鉴定。[0021] 2、pGEX-6p-l线性化载体、GyV3病毒VP3基因片段的PCR扩增:如图1中的步骤I所示分别以PGEX-6P-1质粒以及合成的GyV3VP3基因为模版，采用上述合成的对应弓I物进行PCR扩增。[0022] PCR扩增反应体系为:40μ1水，5μ110倍缓冲液，Ιμΐ10mMάΝΤΡ,ΙμΙ10ymol上游引物，lyl10μπιοί下游引物，ΙμΐlOngμΙ的pGEX_6p_l质粒或pcGyV3_VP3质粒，Ιμΐ商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为:94°C变性5分钟，随后进行30个循环94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸3分钟，最后72°C延伸10分钟。[0023] PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析图，其中泳道1、2分别代表线性化载体pGEX_6p-l以及GyV3病毒VP3片段PCR扩增产物的电泳分析图。[0024] 从图2可见，采用以上方法分别PCR扩增出了pGEX-6p-l线性化载体和GyV3病毒VP3基因片段。[0025] 3、GyV3病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p_l载体:如图1中的步骤2所示，将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-l以及GyV3病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组克隆。[0026] 具体操作如下:将纯化的GyV3病毒VP3片段产物50〜lOOng、纯化的pGEX-6p-l表达线性化载体50ng、2yL商品化的ExnaseTMII酶和4yL5倍的缓冲液水混合，再补加水至20μL。将以上反应物于37°C作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20yL反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。经16小时后挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定即为阳性克隆体，命名为PGEX-VP3。[0027] 4、GyV3病毒VP3蛋白诱导表达及其纯化:将阳性克隆体PGEX-VP3转化BL21细菌，经IPTG诱导0.1mmolmL后收集细菌，进行超声40赫兹破碎。[0028] 将超声破碎样品离心后分别取得上清和沉淀。分别取30yL裂解上清和沉淀，加入5yL6XSDS凝胶上样缓冲液混匀，煮沸5min;用于SDS-PAGE5%的浓缩胶，10%的分离胶电泳分析重组蛋白的表达及其表达形式。同时设立转化空载体的细菌裂解上清和沉淀对照。图3显示了SDS-PAGE分析VP3蛋白的表达结果，其中:泳道I为转化有pGEX_VP3重组克隆的细菌裂解沉淀，泳道2为转化有pGEX-VP3重组克隆的细菌裂解上清。与转化有空载体的细菌裂解上清泳道5和沉淀泳道4比较，泳道2中在40kD处可见一特异性差异表达蛋白条带。这表明，GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的纯化。图3泳道3为纯化后的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。[0029] 5、GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的免疫反应性:为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原，将纯化的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白腹腔免疫6周龄BALBC小鼠，免疫三次，每次间隔14天，剂量均为50yg只次。首免时与等体积的完全弗氏佐剂混合至油包水状，再次免疫时与等体积的不完全弗氏佐剂混合，之后免疫不加佐剂。三免后采集小鼠血清，用在293T细胞中表达的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白作为抗原进行Westernblot分析血清中抗VP3特异性抗体。如图4所示:其中泳道I为转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物;泳道2为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。由图4可见:这一结果表明本发明表达的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV3血清学诊断中将具有良好的应用前景。[0030] 〈110〉扬州大学〈120〉一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法41〈21129DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据pGEX-6p-l基因序列设计1taatgacggtgaaaacctctgacacatgc2〈21129DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据pGEX-6p-l基因序列设计2catgggcccctggaacagaacttccagat3〈21130DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据GyV3病毒VP3基因片段设计3gttccaggggcccatggaaccgggacttgg4〈21130DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据GyV3病毒VP3基因片段设计4gttttcaccgtcattacagtcttagccttt

权利要求：1.一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤:1以pGEX-6p-l质粒为模板，采用下述引物PCR扩增出pGEX-6p-l线性化表达载体；上游引物:5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；下游引物:5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’；2以人工合成的GyV3-VP3基因为模板，采用下述引物PCR扩增出VP3基因片段；上游引物:5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；下游引物:5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’；3在重组酶ExnaseTM II的作用下，将所述pGEX_6p_l线性化表达载体和VP3基因片段进行重组克隆，取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。

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