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申请/专利权人：广东海洋大学

摘要：本发明公开了一种芽孢杆菌（Bacillus sp）CAMT22370，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015247。该芽孢杆菌能够高产低温葡萄糖氧化酶，从而具有良好的保鲜效果，适用于对虾等水产品的物流保鲜。本发明还公开了使用该菌株进行发酵生产葡萄糖氧化酶的方法。该方法简单易行，同时产量和生产效率都获得了大幅的提高。

主权项：一种芽孢杆菌Bacillus spCAMT22370，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015247。

全文数据：_种芽孢杆菌83以丨丨1^8口.0八1^22370及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种微生物筛选及发酵领域，具体涉及BaciiiusspCAMT22370及其液体发酵产葡萄糖氧化酶的方法。背景技术[0002]葡萄糖氧化酶6111〇〇86^1^86,600$]1.1.3.4.利用氧分子作为电子受体，专一性地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，从而有效地将氧去除。由于其天然无毒副作用而被广泛地用于食品加工、医药及生物领域。基于其独特的脱氧效果而产生的保鲜作用，目前已在水果、面制品、酒类、乳品等领域广泛应用。马清河等已初步尝试将商品化的葡萄糖氧化酶应用于对虾保鲜，结果表明在4°C的冷藏条件下较对照延长了约1天的保鲜期，预示着葡萄糖氧化酶在对虾保鲜领域将会产生良好的效果。[0003]目前葡萄糖氧化酶的工业化生产主要采用陆生黑曲霉或青霉固体或液态发酵，但在发酵过程中存在表达量较低以及杂蛋白较多的缺陷，给分离纯化带来很大困难，导致产品成本增高，是制约该酶在食品领域广泛应用的限制因素。目前我国生产的葡萄糖氧化酶工业酶制剂纯度普遍较低，长期以来依赖进口，因此寻找葡萄糖氧化酶进口酶制剂的替代产品具有重要现实意义。同时，已报道的陆生菌株来源葡萄糖氧化酶最适温度多在30-40Γ的温度范围，而在O-HTC的食品冷链温度下活力相对较低，保鲜效果不佳。发明内容[0004]基于目前葡萄糖氧化酶生产菌株陆生来源所存在的产酶活力较低、低温条件下活性不强，以及发酵产物杂蛋白含量较高的局限性，本发明提供了一种从海洋资源中分离低温葡萄糖氧化酶高产菌株的方法及其产葡萄糖氧化酶的应用。[0005]本发明目的之一是提供了一种可产低温葡萄糖氧化酶的海洋菌株。[0006]本发明目的之二是提供了一种利用目标菌株产低温葡萄糖氧化酶的应用。[0007]为此，本发明提供了一株芽孢杆菌BacihusspCAMT22370,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015247。本发明的芽孢杆菌BaciϋusSp.CAMT22370是可生产低温葡萄糖氧化酶的深海菌株，该菌于2015年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，该保藏中心简称为CCTCC，保藏单位地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCCNo:Μ2015247。[0008]本发明的芽孢杆菌CCTCCNO:M2015247可采用含蛋白胨和酵母膏的培养基进行培养，例如:蛋白胨5g，酵母膏Ig，硫酸亚铁0.1g，天然海水IL，pH7.6-7.8。[0009]本发明还提供了上述芽孢杆菌在发酵生产葡萄糖氧化酶中的应用。[0010]优选地，所述葡萄糖氧化酶在低温〇〜10°c下活力大于4UmL。[0011]本发明还提供了一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其采用芽孢杆菌BaciiiusSp.CAMT22370发酵制得。优选地，所述发酵为液体发酵。[0012]本发明通过单因素试验对芽孢杆菌Bacihussp.CAMT22370液体发酵产葡萄糖氧化酶的条件进行了优化。[0013]本发明公开了芽孢杆菌Bacihussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。该菌株来源于深海，其发酵最适碳源为麦芽糖，氮源谱广，但以有机氮为佳，常规无机盐种类对产酶活力影响不显著，以添加0.05%质量比的CaCl2较为适宜。例如：麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化|i52.8g，氯化钠lg，吐温-801.5mL，去离子水IL，pH7.5。发酵条件可以是:接种量2〜10%体积分数，产酶温度22〜37°C，发酵时间36〜84h，转速0〜250rpm;更优选地，接种量为6〜8%体积分数），产酶温度30〜35°C，发酵时间40〜72h，转速150〜250rpm。最优选地，发酵时适宜接种量为7%体积分数），产酶温度为31°C，适宜发酵时间为60h，适宜转速为200rpm，此时酶活力达到13UmL以上。[0014]本发明的有益效果是：[0015]本发明提供的芽孢杆菌Baciiiussp.CAMT22370能够产生低温葡萄糖氧化酶，该酶在0〜KTC的食品冷链温度下的酶活相对于传统黑曲霉等来源的葡萄糖氧化酶显著提高，从而大幅改善在低温下的保鲜效果，十分适合用于水产品的低温保鲜，特别是对虾等水产食品的物流保鲜。也可应用于水果、面制品、酒类、乳品等领域的保鲜。在用于保鲜时，可用本发明的低温葡萄糖氧化酶取代传统的葡萄糖氧化酶制备保鲜剂，在捕捞后清洗过程中通过浸泡5〜15min处理对虾，然后沥干含酶保鲜剂，其余保鲜技术和手段可保持不变。[0016]不仅如此，本发明提供的芽孢杆菌Baciiiussp.CAMT22370菌株还能够高产低温葡萄糖氧化酶。[0017]现阶段商品化的葡萄糖氧化酶都是由霉菌发酵产生，存在产酶活力低及分离复杂的缺陷。以芽孢杆菌BaciiiusSp.CAMT2237进行发酵，产生的低温葡萄糖氧化酶不仅酶活力尚，而且分尚容易。[0018]本发明提供的芽孢杆菌BaciHussp.CAMT22370遗传稳定性好，能够稳定地保持其高产低温葡萄糖氧化酶的优良性状。[0019]本发明还提供了一种葡萄糖氧化酶的制备方法，通过在传统发酵产葡萄糖氧化酶的工艺中，采用芽孢杆菌Baciiiussp.CAMT22370来进行发酵，能够高产大量的低温葡萄糖氧化酶。发酵过程简单易行，同时产量和生产效率都获得了大幅的提高。附图说明[0020]图1为碳源种类对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶活力的影响图；[0021]图2为氮源种类对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶活力的影响图；[0022]图3为无机盐种类对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶活力的影响图；[0023]图4为装液量对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的影响图；[0024]图5为接种量对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的影响图；[0025]图6为发酵温度对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的影响图；[0026]图7为发酵时间对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的影响图；[0027]图8为转速对BaciHussp.CAMT22370产葡萄糖氧化酶的影响图；[0028]图9为含酶发酵液对对虾冷藏过程中黑变进程的影响图；[0029]图10为含酶发酵液对对虾冷藏过程中微生物繁殖速度的影响图。具体实施方式[0030]在本发明中，酶活力的定义为每分钟催化产生1.0ygH2O2的量即为一个酶活力单位。除在特定背景下或特别说明，酶活力均在室温25Ό下测定。[0031]以下实施例采用的培养基为：[0032]富集及种子培养基:蛋白胨5g，酵母膏Ig，硫酸亚铁0.Ig，天然海水IL，pH7.6-7.8。[0033]发酵培养基:麦芽糖5g，酵母粉IOg，氯化钙2.Sg，氯化钠Ig，吐温-801.5mL，去离子水lL，pH7.5。[0034]实施例1:产葡萄糖氧化酶菌株的筛选[0035]本发明芽孢杆菌CAMT22370的筛选方法包括以下步骤：[0036]1细菌的富集:称取Ig海泥于9ml的无菌海水试管中震荡均匀，静置，取上清液逐级稀释至ΙΟΛΠΓ3,KT4倍，震荡均匀后各取ImL不同浓度的样液分别接种至各培养基中，放于30Γ培养箱中倒置培养。[0037]⑵初筛:将富集菌体稀释至约IO4AiL浓度，根据产物H2O2可将亚甲基蓝氧化为无色，设计含有亚甲基蓝浓度梯度的显色培养基，将稀释菌悬液采用稀释涂布法接种于显色培养基，在30°C下培养48h后根据菌体周围无色透明圈的大小初步判定产葡萄糖氧化酶活力高低，挑选若干菌株进行后续摇瓶发酵复筛。[0038]3复筛:复筛主要采用酶标仪对初筛菌株的发酵液中的葡萄糖氧化酶活力进行快速比较筛选。利用葡萄糖氧化酶37°C催化葡萄糖产生的H2O2可使靛蓝胭脂红褪色，其褪色程度在一定范围内与产生的H2O2量呈正相关，据此通过标准曲线计算出催化产物H2O2量，评价酶活力高低。酶活力的定义为每分钟催化产生1.0MgH2O2的量即为一个酶活力单位。可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝G-250法测定。[0039]实施例2产葡萄糖氧化酶菌株的鉴定[0040]对实施例1筛选出的菌株，采用形态学和分子生物学方法对其进行鉴定。[0041]形态鉴定主要采用菌落形态和显微形态进行观察，生理生化鉴定根据菌株的代谢历程采用糖酵解试验、淀粉水解试验、V-P试验、甲基红试验、氧化酶试验、三糖铁琼脂试验和硫化氢靛基质-动力琼脂试验的方法进行，分子生物学鉴定采用16SrDNA测序与比对的方法进行鉴定。综合对形态、生理生化和生物分子学鉴定结果进行菌株归属。[0042]其中，分子生物学鉴定首先采用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，然后采用通用引物进行PCR扩增，扩增体系及程序按常规操作参数，PCR产物纯化后完成测定的16SrDNA基因基因片段长度为1492bp，经比对，与BaciHussp相似性最高，同源性达100%。[0043]结果显示，筛选得到的菌株具有以下特征：（1菌落形态：白色，直径较小，呈圆形，表面光滑，低凸起，较透明，边缘整齐；（2细胞形态:杆状，单个排列，单端生鞭毛，革兰氏阳性；（3:生理生化特征:生长温度为4-40°C，好氧，能耐受7%wt氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素，能利用硫酸铵、硝酸铵、D-氨基葡萄糖，可利用糖原、麦芽三糖、D-海藻糖、D-核糖为碳源，不能利用菊粉、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、甘露醇和木糖，吲哚反应为阴性，甲基红试验、接触酶、氧化酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶试验为阳性，产过氧化氢酶，不产硫化氢。[0044]该菌株经16SrDNA鉴定，测得基因片段长度为1492bp。将获得的基因序列输入Genbank，应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示，与芽孢杆菌Baciiiussp的16SrDNA序列的同源性为100%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为芽孢杆菌BaciHusSp，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015247。[0045]实施例3芽孢杆菌CAMT22370液体发酵产葡萄糖氧化酶条件优化[0046]本实验对筛选得到的芽孢杆菌CAMT22370的产酶条件进行了优化。具体而言，主要是对液体发酵产葡萄糖氧化酶的培养基和培养条件进行优化。除非特别说明，以下百分数为重量百分数。[0047]碳源种类的筛选:在0.3%牛肉膏，0.5%氯化钠的基础上，以1%的添加量分别加入葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，山梨醇，甘露糖，制成只含某一碳源的培养基。发酵接种量为5%体积比），转速150rpm，28°C恒温发酵培养72h，测定酶活力，以酶活力为判定标准，产酶量最大的碳源即为最佳发酵碳源，结果见图1。结果表明1%的麦芽糖为最佳碳源。[0048]氮源种类的筛选:在1%麦芽糖，0.5%氯化钠的基础上，以0.5%的添加量分别加入多价蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，际蛋白胨，胰蛋白胨，鱼蛋白胨，尿素，磷酸氢二铵及硝酸铵，制成只含单一氮源的培养基。发酵接种量为5%体积比），转速150rpm，28°C恒温发酵培养72h，测定酶活力，以酶活力为判定标准，产酶量最大的氮源即为最佳发酵氮源，结果见图2。结果表明有机氮优于无机氮，有机氮之间对产酶影响不大，综合考虑以0.5%的蛋白胨为适宜氮源。[0049]无机盐种类的筛选:在1%麦芽糖，0.5%蛋白胨的基础上，以0.05%的添加量分别加入〇：12、1%3〇4、1：1、111：12、211：12、？63〇4，制成只含某一无机盐的液体培养基。发酵接种量为5%体积比），转速150rpm，28°C恒温发酵培养72h，测定酶活力，以酶活力为判定标准，产酶量最大的无机盐即为最佳无机盐，结果见图3。结果表明无机盐种类对产酶活力影响不大，综合考虑以添加〇.05%的CaCl2较为适宜。[0050]摇瓶装液量的优化：在培养基组成确定的基础上，采用250mL锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为总体积的10%、20%、30%、40%、50%、60%，在35°C，150rpm条件下发酵72h，测定发酵液中葡萄糖氧化酶酶活，结果如图4。结果表明装液量为20%时酶活最高，随着装液量的增加，葡萄糖氧化酶酶活迅速降低。[0051]接种量的优化:在250mL锥形瓶内装20%发酵培养基，分别接种2%、4%、6%、8%、10%的种子液，35°C，150rpm条件下发酵72h，测定发酵液中葡萄糖氧化酶酶活，结果如图5。结果表明6%的接种量较为适宜。[0052]发酵温度的优化:将接种后的三角瓶分别置于22°C、25°C、28°C、31°C、34°C、37°C下，150rpm，装液量为20%，发酵培养72h。测其发酵液中葡萄糖氧化酶酶活，结果如图6。结果表明在31°C下发酵产酶活力较高。[0053]发酵时间优化:将接种后装液量为20%，接种量6%的三角瓶分别置于31°C，150rpm，培养84h，每隔12h取样，测其葡萄糖氧化酶酶活，结果如图7。结果表明发酵60h时产酶活力达到最大，之后酶活有较小幅度下降。[0054]转速的优化:将接种后装液量为20%，接种量6%的三角瓶分别置于31°C培养60h，转速分别设定为静置、50印111、10^111、150印111、20^1]1、250印111，考察转速对产酶活力的影响，结果见图8。结果表明200rpm时产酶活力达到最大。[0055]实施例4:芽孢杆菌CAMT22370的遗传稳定性研究[0056]将芽孢杆菌CAMT22370连续传代培养，并测其酶活，以酶活力作为评价遗传稳定性的指标。结果如表1所示，传代8次，葡萄糖氧化酶活力保持在13UmL左右，标准偏差为0.75，表明菌株有较好的遗传稳定性。[0057]表1芽孢杆菌CAMT22370的传代稳定性[0059]实施例5:—种低温葡萄糖氧化酶的制备方法[0060]按照以下方法制备低温葡萄糖氧化酶：[0061]1配制发酵培养基：麦芽糖5g，酵母粉IOg，氯化钙2.Sg，氯化钠Ig，吐温-801.5mL，去离子水lL，pH7.5。[0062]2用常规方法活化芽孢杆菌CAMT22370,并制备种子液，其中种子培养基为:蛋白胨5g，酵母膏Ig，硫酸亚铁0.Ig，天然海水IL，pH7.6-7.8。[0063]3往发酵培养基中接入6%体积分数）的种子液，于28°C摇床培养60h，转速200rpm。[0064]4收集发酵液，离心取上清，测定葡萄糖氧化酶的活力。[0065]实施例6:芽孢杆菌CAMT22370发酵产葡萄糖氧化酶低温下的酶活力变化[0066]取实施例5芽孢杆菌CAMT22370发酵所产葡萄糖氧化酶及条件相同下黑曲霉04.m_gerCICC3357产生的葡萄糖氧化酶，分别测定两种酶在0〜10°C下的酶活力n=3，黑曲霉产酶培养基为常规马铃薯蔗糖培养基，培养条件同芽孢杆菌CAMT22370。结果如表2所不。[0067]表2芽孢杆菌CAMT22370与黑曲霉CICC3357低温下酶活力的比较UmL[0068][0069]由表2可见，黑曲霉A.nigerCICC3357产生的葡萄糖氧化酶在0〜10°C低温下的酶活力基本不超过4UmL，本发明产生的葡萄糖氧化酶在此低温下的酶活力超过5UmL，相对于黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶活力大幅提高。[0070]实施例7:芽孢杆菌CAMT22370与黑曲霉CICC3357产葡萄糖氧化酶能力比较[0071]采用与实施例6相同的方法产生葡萄糖氧化酶，分别测定芽孢杆菌CAMT22370和黑曲霉CICC3357在发酵24、36、48、60、72和8处时所产葡萄糖氧化酶的酶活力，并进行比较，结果如表3所;^。[0072]表3芽孢杆菌CAMT22370与黑曲霉CICC3357产葡萄糖氧化酶活力变化UmL[0073][0074]由表3可见，黑曲霉CICC3357产生的葡萄糖氧化酶在24〜84h内产酶能力基本不超过llUmL，本发明产生的葡萄糖氧化酶在此发酵时间内产酶能力可接近15UmL，因此相对于黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶而言，本发明产酶能力大幅提高。[0075]实施例8:—种低温葡萄糖氧化酶的制备方法[0076]按照以下方法制备低温葡萄糖氧化酶：[0077]1配制发酵培养基：麦芽糖5g，酵母粉IOg，氯化钙2.Sg，氯化钠Ig，吐温-801.5mL，去离子水lL，pH7.5。[0078]2用常规方法活化芽孢杆菌CAMT22370,并制备种子液，其中种子培养基为:蛋白胨5g，酵母膏Ig，硫酸亚铁0.Ig，天然海水IL，pH7.6-7.8。[0079]3往发酵培养基中接入7%体积分数）的种子液，于31°C摇床培养60h，转速200rpm〇[0080]4收集发酵液，离心取上清，测定葡萄糖氧化酶的活力。[0081]结果显示，发酵液中葡萄糖氧化酶在4°C低温下的活力为4.21UmL，产量13.89UmL〇[0082]实施例9.使用低温葡萄糖氧化酶进行保鲜[0083]将捕捞后大小均一、健康的南美白对虾采用充氧保活的方法保活运回实验室，暂养3天后剔除死亡、肢体残缺、变色等异常个体，用无菌水冲洗，放入碎冰中使虾体休克，将休克后的南美白对虾用含酶复合生物保鲜剂包含0.1%重量的上述实施例8中制备好的葡萄糖氧化酶，1%重量的茶多酚，1%水溶性壳聚糖，其余为水浸泡5min，然后捞出沥去虾体表面多余的发酵液，冷风吹干并装入无菌保鲜袋内，将装袋后的对虾放置于4°C冰箱内冷藏。同时以蒸馏水浸泡组作为阴性对照，以市售保鲜剂虾鲜宝作为阳性对照，其使用方法按照说明书进行。[0084]采用色差计跟踪检测三组南美白对虾在冷藏期间的色泽变化，色差测定采用WSC-I型微处理色差计，光圈直径30mm，聚光镜直径30mm，用标准陶瓷板（Χ=91·295，Υ=94.295，Ζ=107.045作为工作标准，测量对虾表面在测样盒中的反射光，由三刺激值Χ、Υ、Ζ计算出L值。其中L表示颜色透明度，L=O为黑色，L=IOO为白色，L值越小，表示黑变越重，以明度值L作为对虾黑变程度的指标，每组数值重复测三次取平均值，结果见图9。由图9可以看出，与对照相比，含本发明葡萄糖氧化酶发酵液的保鲜剂可有效减缓对虾在冷藏期间的黑变进程。[0085]菌落总数测定采用GBT4789.2-2010《食品微生物学检验总则》进行，将南美白对虾样品放入超声匀浆器充分匀浆，将匀浆液在超净工作台上称取Ig加入9mL无菌水，搅拌均匀后成HT1梯度菌悬液，依次操作制备系列稀释度菌悬液。移液枪移取ImL不同稀释度的菌悬液，用倾注法接种于营养琼脂无菌培养皿内，快速混匀后倒置于37°C恒温培养箱培养2-3天，然后按照标准程序进行菌落计数，比较不同处理对南美白对虾微生物繁殖的影响，结果见图10。[0086]由图10可以看出，不同处理对细菌繁殖速度影响显著，蒸馏水浸泡组细菌快速繁殖，第4天超过7.0,失去商品价值，虾鲜宝组细菌繁殖速度较蒸馏水组明显下降，但仍处于缓慢上升状态，在冷藏至第5天时仍能较好保持微生物品质，与前两个处理不同，含本发明葡萄糖氧化酶的发酵液组细菌菌落总数一直处于低于5.0的较低状态，较好地抑制了微生物繁殖。

权利要求：1.一种芽孢杆菌BaciIIusspCAMT22370，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0:M2015247。2.权利要求1的芽孢杆菌CAMT22370在发酵生产葡萄糖氧化酶中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述葡萄糖氧化酶在O〜KTC下活力大于4UmL。4.一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：其采用权利要求1所述的芽孢杆菌CAMT22370发酵制得。5.根据权利要求4所述的一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于:所述发酵为液体发酵，发酵的培养基采用麦芽糖作为碳源，以有机氮作为氮源，并添加有CaC12。6.根据权利要求4所述的一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于:发酵条件为:接种量2〜10%体积，产酶温度22〜37°C，发酵时间36〜84h，转速O〜250rpm。7.根据权利要求4所述的一种葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于:发酵条件为:接种量6〜8%体积，产酶温度30〜35°C，发酵时间40〜72h，转速150〜250rpm。

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