申请/专利权人：山东理工大学

申请日：2016-06-20

公开（公告）日：2016-11-16

公开（公告）号：CN106124586A

主分类号：G01N27/327(2006.01)I

分类号：G01N27/327(2006.01)I;G01N33/576(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2020.06.23#未缴年费专利权终止;2018.08.14#授权;2016.12.14#实质审查的生效;2016.11.16#公开

摘要：本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法及应用。分别采用SnO2‑GS@Au@Pt NPs、SnO2‑GS@Ag‑cys‑Au纳米材料作为检测抗体标记物，制备的夹心型电化学免疫传感器实现了对乙肝病毒标志物HBs和HBe的同时检测，具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对乙肝病毒标志物HBsHBe的检测具有重要的科学意义和临床应用价值。

主权项：一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将上述电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl4溶液中，在‑0.2 V电压下，电镀30 s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti‑HBs和Anti‑HBe浓度分别为8 ~ 12 µgmL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h， 取出4℃冰箱中晾干；（4）继续将3 µL，1 ~ 3 mgmL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；（5）再将上述电极浸入0.1 pgmL ~ 50 ngmL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@Au@Pt NPs‑HBs‑Ab2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2的浓度分别为1 ~ 3 mgmL的混合液中，室温下孵化50 min，置于4 ℃冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器。

全文数据：一种同吋检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法及应用技术领域[0001]本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法及应用。背景技术[0002]乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。因此乙肝病毒标志物的的准确检测，对乙型肝炎的治疗能起到重要作用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低、等优点，在临床检验领域具有重要的应用价值。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面;其二是开发传感器的信号放大技术。发明内容[0003]本发明提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法及应用，实现了乙肝病毒标志物HBs和HBe的尚灵敏同时检测。[0004]本发明的目的之一是提供一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法。[0005]本发明的目的之二是将所制备的同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器，用于乙肝病毒标志物HBs和HBe的同时检测。[0006]本发明的技术方案，包括以下步骤。[0007]1.—种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，步骤如下：[0008]1将直径为3〜5mm的玻碳电极用A1203抛光粉打磨，超纯水清洗干净；[0009]2将上述电极浸入10mL、质量分数为1%HAuC14溶液中，在-0.2V电压下，电镀30s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；[0010]3继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBdpAnU-pffie浓度分别为8〜I2ygmL的混合溶液中，4°C冰箱中孵化12h，取出4°C冰箱中晾干；[0011]4继续将3yL，l〜3mgmL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；[0012]5再将上述电极浸入0.1pgmL〜50ngmL—系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37°C孵化50min;室温下晾干，超纯水冲洗，4r冰箱中干燥；[0013]6最后将上述步骤5修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPs-HBs-Abs和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的浓度分别为1〜3mgmL的混合液中，室温下孵化50min，置于4°C冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器。[0014]2.所述检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2的制备，步骤如下：[0015]1Au@PtNPs制备[0016]将1〜3mL、质量分数为1%HAuCU溶液加入到100mL超纯水中，搅拌下快速加入3〜6mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；[0017]将3〜7mL、质量分数为1%的趾比16溶液加入煮沸的上述HAuCU溶液中，再加入2〜4mL、0.1moLL的抗坏血酸溶液，加热30min，制得Au@PtNPs的溶液；[0018]2Sn〇2_GS@Au@PtNPs的制备[0019]〇.i〜〇.3mL、0.5mgmLSn〇2_GS与6mL上述制备Au@PtNPs溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤千燥，产物重新分散在超纯水中制成1〜3mgmL的Sn〇2_GS@Au@PtNPs溶液；[0020]⑶检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPsHBs-Ab2的制备[0021]将1〜3mL、10ugmL的HBs检测抗体Ab2与1mL、l〜3mgmL的Sn〇2-GS@Au@PtNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤，制得Sn〇2_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2检测抗体孵化物;用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1〜3mgmL的检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Au@PtNPsHBs-Ab2备用。[0022]3•所述检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPS-HBe-Ab2的制备，步骤如下：[0023]1Ag-cys-Au纳米球的制备[0024]1L-cysOAuNPs的制备[0025]在20〜30mL、2mm〇LL的L-半胱氨酸L-cys溶液中，边搅拌边依次加入250uL、0.〇5moLL的HA11CI4溶液，35〇此、0.01moLL的NaBH4，在3〇〇K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L-cys@AuNPs，备用；[0026]2Ag-cys-Au纳米球的制备[0027]10〜15mL、0•1mgmL的L-cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙燦吡咯烷酮PVP，1mL、0.1moLL的抗坏血酸，1mL，0.1moLL的AgN03溶液，室温下搅拌30〜40min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空干燥制得Ag-cys-Au纳米球；[0028]⑵Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs的制备[0029]0.1〜0_3mL、0_5mgmLSn〇2_GS与6mL、l〜3mgmL的Ag-cys-Au纳米球溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1〜3mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs溶液；[0030]3检测抗体孵化物溶液SnOrGSOAg-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备[0031]将1〜3mL、10ugmL的HBe检测抗体Ab2与1mL、l〜3mgmL的Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗潘;制得Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2捕获抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1〜3mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2检测抗体孵化物溶液备用。[0032]4.乙肝病毒标志物HBsHBe的同时检测，步骤如下：[0033]1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmolL的pH5.1〜8.6磷酸盐缓冲溶液中进行测试；[0034]2用计时电流法对乙肝病毒标志物HBsHBe进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s;[0035]3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7.4憐酸盐缓冲溶液中注入10UL、5molL的双氧水溶液，记录电流变化。[0036]本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。[0037]本发明的有益成果[0038]1本发明使用了电镀金作为基底材料，金具有良好的导电性，以及优良的生物相容性，能够很好的固载捕获抗体，并能加速电子的传递，对于实现传感器的高灵敏度以及低检测限具有重要意义。[0039]2分别采用Sn02-GS@Au@PtNPs、Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs作为检测抗体标记物，Sn02-GS具有大的比表面积，Pt、Au和Ag具有良好的导电能力以及对过氧化氢有催化作用，实现了信号的协同放大，因此提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；[0040]3—种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器对两种乙肝病毒标志物HBsHBe的检测，其线性范围均达到0.1pgmL〜50ngmL，检测限达0.033pgmL。具体实施方式[0041]现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。[0042]实施例1一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，步骤如下：[0043]⑴将直径为3mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；[0044]2将上述电极浸入10mL、质量分数为1%HAuCl4溶液中，在-0.2V电压下，电镀30s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；[0045]3继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为8ygmL的混合溶液中，4°C冰箱中孵化12h，取出4°C冰箱中晾干；[0046]4继续将3yL，lmgmL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；[0047]5再将上述电极浸入o.lPgmL〜50ngmL—系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37°C孵化50min;室温下晾干，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；[0048]6最后将上述步骤f5修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPs-HBs-Abs和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的浓度分别为1mgmL的混合液中，室温下孵化50min，置于4°C冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器。[0049]实施例2—种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，步骤如下：[0050]1将直径为4mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；[0051]2将上述电极浸入10mL、质量分数为1%HAuC14溶液中，在-0.2V电压下，电镀30s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；_2]⑶继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为10ygmL的混合溶液中，4°C冰箱中孵化12h，取出4。：冰箱中晾干；[0053]⑷继续将3uL，2mgmL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4。：冰箱中晾干；[00M]5再将上述电极浸入0.1pgmL〜50ngmL—系列不同浓度的HBS和HBe抗原混合溶液中37°C孵化50min;室温下晾干，超纯水冲洗，4°C冰箱中千燥；[0055]6最后将上述步骤5修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ah的浓度分别为2mgmL的混合液中，室温下孵化5〇min，置于4°C冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器。[0056]实施例3—种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，步骤如下：[0057]⑴将直径为5mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；[0058]2将上述电极浸入10mL、质量分数为1%HAuC14溶液中，在-0.2V电压下，电镀30s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；[0059]3继续将上述电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-ffie浓度分别为12ygmL的混合溶液中，4°C冰箱中孵化12h，取出4。：冰箱中晾干；[0060]4继续将3yL，3mgmL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；[0061]5再将上述电极浸入0_1pgmL〜50ngmL—系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37°C孵化50min;室温下晾干，超纯水冲洗，4-C冰箱中干燥；[0062]6最后将上述步骤5修饰的电极浸入二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物彳谷液Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的浓度分别为3mgmL的混合液中，室温下孵化50min，置于4°C冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器。[0063]实施例4所述检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2的制备，步骤如下：[0064]1Au@PtNPs制备[0065]将1mL、质量分数为1%HAuC14溶液加入到100mL超纯水中，搅拌下快速加入3mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；[0066]将3mL、质量分数为1%的H2PtCl6溶液加入煮沸的上述HAuCl4溶液中，再加入2111匕、0.1111〇1几的抗坏血酸溶液，加热3〇111；[11，制得411@?七即8的溶液；[0067]⑵Sn〇2_GS@AuOPtNPs的制备[0068]0.1mL、0.5mgmLSn02-GS与6mL上述制备Au@PtNPs溶液混合搅拌12h,离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1mgmL的Sn02-GS@Au@PtNPs溶液；[0069]3检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Au@PtNPsHBs-Ab2的制备[0070]将1mL、10ugmL的HBs检测抗体Ab2与1mL、lmgmL的Sn〇2_GS@AuOPtNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤，制得Sn02-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2检测抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1mgmL的检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@AuOPtNPsHBs-Ab2备用。[0071]实施例5所述检测抗体孵化物溶液Sn02_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2的制备，步骤如下：[0072]⑴Au@PtNPs制备[0073]将2‘、质量分数为1%必11：14溶液加入到10〇11^超纯水中，搅拌下快速加入4.5mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；[0074]将5mL、质量分数为1%的H2PtCl6溶液加入煮沸的上述HAuCl4溶液中，再加入31^、0.1111〇171^的抗坏血酸溶液，加热3〇11^，制得41_^陬3的溶液；[0075]⑵Sn〇2_GS@Au@PtNPs的制备[0076]0.2mL、0.5mgmLSn〇2_GS与6mL上述制备Au@PtNPs溶液混合搅拌12h,离心分离，洗涤千燥，产物重新分散在超纯水中制成2mgmL的Sn02-GS@Au@PtNPs溶液；[0077]3检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Au@PtNPsHBs-Ab2的制备[0078]将2mL、10ygmL的HBs检测抗体Ab2与1mL、2mgmL的Sn〇2-GS@Au@PtNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤，制得Sn02_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2检测抗体孵化物;用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成2mgmL的检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Au@PtNPsHBs-Ab2备用。[0079]实施例6所述检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2的制备，步骤如下：[0080]1Au@PtNPs制备[0081]将3mL、质量分数为1%HAuCl4溶液加入到100mL超纯水中，搅拌下快速加入6mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；[0082]将7mL、质量分数为1%的H2PtCl6溶液加入煮沸的上述HAuCl4溶液中，再加入411^、0.1111〇171^的抗坏血酸溶液，加热3〇111111，制得八11班^肥3的溶液；[0083]⑵Sn〇2_GS@Au@PtNPs的制备[0084]0.3mL、0.5mgmLSn02-GS与6mL上述制备Au@PtNPs溶液混合搅拌12h,离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成3mgmL的Sn〇2_GS@Au@PtNPs溶液；[0085]3检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Au@PtNPsHBs-Ab2的制备[0086]将3mL、10UgmL的HBs检测抗体Ab2与1mL、3mgmL的Sn〇2_GS@AuOPtNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤，制得Sn02_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2检测抗体孵化物；用pH7.4的roS缓冲溶液重新分散，制成3mgmL的检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@AuOPtNPsHBs-Ab2备用。[0087]实施例7所述检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备，步骤如下：[0088]1Ag-cys-Au纳米球的制备[0089]1L_cys@AuNPs的制备[0090]在20mL、2mmoLL的L-半胱氨酸L-cys溶液中，边搅拌边依次加入250UL、0.05moLL的HA11CI4溶液，35〇yL、0.01moLL的NaBH4，在300K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L-cys@AuNPs，备用；[0091]2Ag-cys-Au纳米球的制备[0092]10mL、0•1mgmL的L_cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙稀卩比咯烧酮PVP，1mL、0.1moLL的抗坏血酸，1mL，0.1moLL的AgN〇3溶液，室温下搅拌3〇min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空千燥制得Ag-cys-Au纳米球；[0093]⑵Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs的制备[0094]0•1mL、0.5mgmLSn〇2-GS与6mL、lmgmL的Ag-cys-Au纳米球溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1〜3mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs溶液；[0095]3检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备[0096]将1mL、10ygmL的HBe检测抗体Ab2与1mL、lmgmL的Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤;制得Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2捕获抗体孵化物；用pH7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成lmgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2检测抗体孵化物溶液备用。[0097]实施例8所述检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备，步骤如下：[0098]1Ag-cys-Au纳米球的制备[0099]1L_cys@AuNPs的制备[0100]在25mL、2mm〇LL的L-半胱氨酸L-cys溶液中，边搅拌边依次加入250uL、0_05moLL的HAuCU溶液，350yL、0.01moLL的NaBH4,在300K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗漆，室温下真空干燥12h，制得L-cys@AuNPs，备用；[0101]2Ag-cys-Au纳米球的制备[0102]12_5mL、0_1mgmL的L-cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙稀P比咯烷酮PVP，1mL、0_lmoLL的抗坏血酸，1mL，0.1moLL的AgN03溶液，室温下搅拌35min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空干燥制得Ag-cys-Au纳米球；[0103]⑵Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs的制备[0104]0.2mL、0_5mgmLSn〇2-GS与6mL、2mgmL的Ag-cys-Au纳米球溶液混合搅拌12h，呙心分离，洗漆干燥，产物重新分散在超纯水中制成2mgmL的Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs溶液；[0105]⑶检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备[0106]将2mL、10ugmL的HBe检测抗体Ab2与1mL、2mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs混合4°C震荡孵化过夜，_心洗潘;制得Sn〇2-GS@Ag-cys_AuNPs-HBe-Ab2捕获抗体孵化物；用卩!17.4的?83缓冲溶液重新分散，制成21^1^的31102-03@48-〇78^11即3-邢6^出检测抗体孵化物溶液备用。[0107]实施例9所述检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备，步骤如下：[0108]1Ag-cys-Au纳米球的制备[0109]1L-cys@AuNPs的制备[0110]在30mL、2mm〇LL的L-半胱氨酸L-cys溶液中，边搅拌边依次加入250UL、0.〇5moLL的HAuCl4溶液，35〇uL、0_01moLL的NaBH4，在3〇〇K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L_cyS@AuNPs，备用；’[0111]2Ag-cys-Au纳米球的制备[0112]15mL、0•1mgmL的L-cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙煤p比略烷酮PVP，1mL、0_lmoLL的抗坏血酸，1mL，0.1moLL的AgN〇3溶液，室温下搅拌4〇min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空千燥制得Ag-cys-Au纳米球；’[0113]⑵Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs的制备[0114]0.3mL、0.5mgmLSn〇2_GS与6mL、3mgmL的Ag-cys-Au纳米球溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成3mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs溶液；[0115]⑶检测抗体孵化物溶液SnOrGSOAg-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备[0116]将3mL、10ygmL的HBe检测抗体Ab2与1mL、3mgmL的Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗潘;制得Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs_HBe-Ab2捕获抗体孵化物；用口117.4的？33缓冲溶液重新分散，制成311^11^的811〇2-〇8@六§-〇7£^11陬3-冊6-八132检测抗体孵化物溶液备用。[0117]实施例10乙肝病毒标志物HBsHBe的同时检测，步骤如下：[0118]1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmolL的pH5.1〜8.6隣酸盐缓冲溶液中进行测试；[0119]2用计时电流法对乙肝病毒标志物HBsHBe进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s;[0120]3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7.4憐酸盐缓冲溶液中注入10yL、5molL的双氧水溶液，记录电流变化；[0121]4采用标准曲线法，测得该方法检测乙肝病毒标志物HBs和HBe的线性范围均为0•lpgmU5〇ngmL，检测限为0•033pgmL。

权利要求：1.一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：1将直径为3〜5mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；2将上述步骤1修饰的电极浸入10mL、质量分数为1%HAuCU溶液中，在-0.2V电压下，电镀30s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；3继续将上述步骤2修饰的电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti-HBs和Anti-HBe浓度分别为8〜12ygmL的混合溶液中，4°C冰箱中孵化12h，取出4°C冰箱中晾千；4继续将3yL，l〜3mgmL的BSA溶液滴加到上述步骤3修饰的电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5再将上述步骤4修饰的电极浸入0.1PgmL〜50ngmL—系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37°C孵化50min;室温下晾干，超纯水冲洗，4°C冰箱中千燥；6最后将上述步骤5修饰的电极浸入浓度分别为1〜3mgmL的二氧化锡石墨烯负载金杂化铀的HBs检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液Sn〇2-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的混合液中，室温下孵化5〇min，置于4°C冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器；所述检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2的制备，其特征在于，步骤如下：1Au@PtNPs制备将1〜3mL、质量分数为1%HAuCl4溶液加入到100mL超纯水中，搅拌下快速加入3〜6mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；将3〜7mL、质量分数为1%的H2PtCl6溶液加入煮沸的上述HAuCU溶液中，再加入2〜41^、0.1111〇171的抗坏血酸溶液，加热3〇111111，制得六11餅^即8的溶液；2SnOrGSOAu@PtNPs的制备0.1〜0.3mL、0.5mgmLSnOrGS与6mL上述制备的Au@PtNPs溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1〜3mgmL的Sn02-GS@Au@PtNPs溶液；3检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@AuOPtNPsHBs-Ab2的制备将1~3mL、10ygmL的HBs检测抗体Ab2与1mL、l〜3mgmL的Sn〇2_GS@AuOPtNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤，制得Sn02-GS@Au@PtNPs-HBs-Ab2检测抗体孵化物；用pH7.4的？33缓冲溶液重新分散，制成1~311^11^的检测抗体孵化物溶液311〇2-65@八11即1NPsHBs-Ab2备用；所述检测抗体孵化物溶液Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe_Ab2的制备，其特征在于，步骤如下：1Ag-cys-Au纳米球的制备1L_cys@AuNPs的制备在20〜30mL、2mmoLL的L-半胱氨酸L-cys溶液中，边搅拌边依次加入250yL、0.05moLL的HAuCU溶液，350nL、0.01moLL的NaBH4，在300K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L-cys@AuNPs，备用；2Ag-cys-Au纳米球的制备10〜15mL、0_1mgmL的L-cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙炼卩比咯烷酮PVP，1mL、0_lmoLL的抗坏血酸，1mL，0_lmoLL的AgN〇3溶液，室温下搅拌30〜40min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空干燥制得Ag-cys-Au纳米球；2Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs的制备0.1〜0_3mL、0_5mgmLSn〇2-GS与6mL、l〜3mgmL的Ag-cys-Au纳米球溶液混合搅拌12h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1〜3mgmL的Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs溶液；3检测抗体孵化物溶液Sn02-GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2的制备将1〜3mL、10ygmL的HBe检测抗体Ab2与1mL、l〜3mgmL的Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs混合4°C震荡孵化过夜，离心洗涤;制得Sn〇2_GS@Ag-cys-AuNPs-HBe-Ab2捕获抗体孵化物；用?^17.4的？33缓冲溶液重新分散，制成1~311^1111的311〇2-63@々8-〇73-411吧3-邢6-Ab2检测抗体孵化物溶液备用。2.如权利要求1所述的一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBsHBe的传感器的制备方法制备的免疫传感器，用于乙肝病毒标志物HBsHBe的同时检测，检测步骤如下：1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在1〇11^、5〇111111〇1几的?115.1〜8.6磷酸盐缓冲溶液中进行测试；2用计时电流法对乙肝病毒标志物HBsHBe进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s;3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10yL、5molL的双氧水溶液，记录电流变化。

百度查询： 山东理工大学 一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD