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申请/专利权人：山东大学

摘要：本发明公开了一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用等步骤。本发明以细胞分裂旺盛的茎尖和叶片为处理材料，能有效地克服基因型制约，获得同质多倍体植株的效率高，对具有重要经济价值的枣的遗传改良有重要价值。

主权项：1.一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用；其特征在于：所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指：将茎尖转入茎延伸培养基生长，将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长；所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是：将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃±2℃黑暗条件下，100rmp摇动24-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30-35天继代一次；所述小苗生根和移栽方法是指：将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗，接种在生根培养基中，进行生根；当根长2-3cm时，移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中，前6-7天盖好封口膜，保持湿度为90％，20℃2～25℃环境下，生长15-20天，之后移至室外土壤中生长，其间每2-3天浇一次12MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次；上述茎延伸培养基是指：添加有1-3mgL-1赤霉素GA3、0.1-0.5mgL-16-苄基嘌呤6-BA和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；上述叶片诱导丛生芽培养基是指：添加有0.5-2mgL-1噻二唑苯基脲TDZ、0.3-1mgL-1吲哚乙酸IAA和100-500mgL-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；上述生根培养基是指：添加有0.1-0.5mgL-1吲哚乙酸IAA，0.2-1mgL-1吲哚丁酸IBA的Nitsh固体培养基；上述MS固体培养基的配方是：KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O440mgL-1，MgSO4·7H2O370mgL-1，KH2PO4·H2O170mgL-1，FeSO4·7H2O27.8mgL-1，EDTA·Na237.3mgL-1，ZnSO4·7H2O10mgL-1，MnSO4·4H2O22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI0.83mgL-1，Na2MoO4·2H2O0.5mgL-1，CuSO4·5H2O0.025mgL-1，CoCl2·6H2O0.025mgL-1，盐酸硫胺素10.0mgL-1，盐酸吡哆醇1.0mgL-1，烟酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，蔗糖30gL-1，琼脂粉6gL-1，pH6.0；上述WPM固体培养基的配方是：NH4NO3400mgL-1，CaCl2·H2O96mgL-1，CaNO32556mgL-1，MgSO4·7H2O370mgL-1，K2SO49900mgL-1，KH2PO4·H2O170mgL-1，FeSO4·7H2O27.8mgL-1，EDTA·Na237.3mgL-1，ZnSO4·7H2O8.6mgL-1，MnSO4·H2O22.3mgL-1，H3BO36.2mgL-1，Na2MoO4·2H2O0.25mgL-1，CuSO4·5H2O0.25mgL-1，盐酸硫胺素1.6mgL-1，烟酸0.5mgL-1，肌醇100.0mgL-1，蔗糖30gL-1，琼脂粉6gL-1，pH6.0；上述Nithsh固体培养基的配方是：KNO3950mgL-1，NH4NO3720mgL-1，CaCl2·2H2O166mgL-1，MgSO4·7H2O185mgL-1，KH2PO4·H2O68mgL-1，FeSO4·7H2O27.85mgL-1，EDTA·Na237.3mgL-1，ZnSO4·7H2O10mgL-1，MnSO4·4H2O25mgL-1，KI10mgL-1，CoCl2·6H2O0.025mgL-1，MoO30.25mgL-1，肌醇5000mgL-1，蔗糖30gL-1，琼脂粉6gL-1，pH6.0；其中，MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指：不添加所述的琼脂粉的配方；上述12MS培养基无机盐溶液是指：MS液体培养基无机盐成分含量的一半。

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