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申请/专利权人：河南科技大学

摘要：本发明公开了一种小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。该方法包括以下步骤：1脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脱水，每个梯度脱水45～60min；2透明：将经脱水处理的皮肤组织浸入100％乙醇与二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；3浸蜡：将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20～30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45～60min；4将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得；其流程简单，操作方便，获得的切片完整，图片结构清晰。

主权项：小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45~60min；（2）透明：将经脱水处理的皮肤组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2~3min，取出后再浸入二甲苯中10~30min；所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1；（3）浸蜡：将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20~30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45~60min；所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1；（4）将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得；所述切片的厚度为4~6μm，切片后置于42~45℃的水中展片；所述贴片、烤片为：待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37~45℃下干燥2~4h，或者于室温下自然干燥一夜；步骤（4）中所述染色为H.E染色，操作步骤为：将切片依次置于二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、100%乙醇Ⅰ5min、100%乙醇Ⅱ5min、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10~20min，流水冲洗5min，再置于HCl‑乙醇分化液20~40s，流水冲洗10~30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇1min、85%乙醇1min、伊红染液2min、95%乙醇Ⅰ2min、95%乙醇Ⅱ2min、100%乙醇Ⅰ2min、100%乙醇Ⅱ2min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min。

全文数据：小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种两栖动物皮肤显微组织切片的制备方法，具体涉及用于显微观察的小鲵科动物皮肤组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。背景技术[0002]皮肤是两栖动物机体的第一道天然屏障，在适应和进化的过程中，担任了呼吸、调节水平衡、离子运输、抵抗猎食者、抗细菌、真菌等多方面的功能，这些功能体现了皮肤形态学特征的复杂性以及皮肤结构潜在的生理特性，对维持两栖动物的生存、开拓和适应广阔的栖息地以及多样的生态环境中起着重要的作用。[0003]小鲵科动物是亚洲特有的有尾类两栖动物，也是现生有尾目10科中第三大科，全世界现已知66种，隶属2亚科、10属。中国现已知2亚科8属30种，主要分布于东北、西南山区、华中及台湾地区。小鲵科动物生活环境可分为水栖型和陆栖型，由于生活环境导致不同生活环境的小鲵科动物之间皮肤形态结构特征的差异，这些形态特征的差异为小鲵科动物的适应进化研究提供了基础数据；同时小鲵科动物被认为是有尾类中最原始的类群，故皮肤形态结构的研究可为两栖动物的进化研究提供依据。故皮肤形态结构特征在两栖动物中，特别是小鲵科动物中的研究受到众多学者的关注。[0004]要研究皮肤的形态结构特征，皮肤石蜡切片的制作是必不可少的一步。非专利文献《小鲵科动物外部形态特征和皮肤组织的形态学研宄》张向，2014公开了一种小鲵皮肤石蜡切片制作方法，包括：（1取材:所采集的小鲵皮肤组织块一般不宜过大，以3〜5mmX3〜5mm为宜，固定后流水冲洗24h;2脱水:依次放入70%乙醇2h、80%乙醇2h、85%乙醇lh、90%乙醇lh、95%乙醇lh、100%乙醇I10min、100%乙醇IIlOmin;⑶透明：将脱水后的组织放入正丁醇115min，正丁醇II15min进行透明处理；（4浸蜡:将皮肤组织放入石蜡I浸蜡30min，再放入纯石蜡n浸蜡2h;5包埋:使用75°C左右的石蜡包埋；（6切片：用单面刀片先将蜡块四周修整平行并切成方形或长方形，把蜡块粘附在木块上，调整刀片与石蜡切片约成5°角，切片厚度为4〜6wii;7展片、贴片、干燥:将切好的组织片用毛笔卷起，慢慢平摊于44°C的温水中进行展片，然后用载玻片将切片挑起，放入烘烤箱中，烘片以玻片没有明显水渍为准；（8冊染色：将石蜡切片组织放入二甲苯15111丨11、100%乙醇1〇111111、95%乙醇5min、85%乙醇5min、75%乙醇5min、蒸馏水5min、苏木素lOmin、流水冲洗5min、l%盐酸酒精分色4〇s左右、流水冲洗蓝化30min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、伊红乙醇5min、95%乙醇4min、100%乙醇4min，再放入二甲苯lOmin共计lh58min，然后用中性树胶封片；（9封固：在载玻片13处滴中性树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，使树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出，干燥，用二甲苯擦干净盖玻片周围多余溢出的树胶，即得。然而，该方法存在以下不足之处：（1脱水不完全，造成石蜡渗透不完全，在切片时引起组织出现破碎或空洞，摊片时切片散开，染色时托片和着色不良等；（2正丁醇脱水效果不佳；（3浸蜡过程由于缺乏过渡步骤，导致从透明步骤携带的二甲苯进入石蜡中，从而造成石蜡浓度降低，另外浸蜡时间过长造成组织块脆硬。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，该方法可有效去除组织块中的水分，防止石蜡渗透不全;提高透明效果，浸蜡时间相对缩短，可防止组织块脆硬。[0006]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0007]小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，包括以下步骤：[0008]1脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度5〇%、7〇%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45〜60min;[0009]2透明：将经脱水皮肤处理的组织浸入100%乙醇与二甲苯的混合液中2〜3min，取出后再浸入二甲苯中10〜30min;[0010]3浸蜡:将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20〜30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45〜60min;[0011]4将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得。[0012]步骤1中乙醇浓度的增加和脱水时间的增加能够更加有效的去除组织块中的水分，从而保证石蜡充分的渗透进入组织细胞，否则将造成石蜡渗透不完全，在切片时引起组织出现破碎或空洞，摊片时切片散开，染色时托片和着色不良等。[0013]步骤⑴中所述脱水在室温下进行。[0014]步骤⑵中所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1。[0015]步骤2中二甲苯在小鲵科动物皮肤组织切片中的透明效果最好，能较好的溶解石蜡。[0016]步骤⑶中采用二甲苯与石蜡的混合液的目的是在透明与浸蜡步骤之间增加一个过渡步骤，以防切片在透明步骤带入过多的二甲苯进入石蜡，从而导致石蜡浓度的降低；同时增加二甲苯与石蜡的过渡步骤后可适当缩短浸蜡时间，以防浸蜡时间过长造成组织块脆硬。[0017]步骤⑶中所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1。[0018]步骤⑷中所述切片的厚度为4〜切片后置于似〜45°C的水中展片。[0019]步骤⑷中所述贴片、烤片为:待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37〜45°C下干燥2〜4h，或者于室温下自然干燥一夜，亦或将切片置于载玻片上，加少量水后持载玻片在酒精灯上加温，使切片伸展。[0020]步骤⑷中所述染色为H.E染色，操作步骤为:将切片依次置于二甲苯IlOmin、二甲苯111〇111：111、1〇〇%乙醇15111：^、1〇〇%乙醇11511^11、95%乙醇5111丨11、85%乙醇5111；[11、75%乙醇5min、水5min、苏木精染液10〜20min，流水冲洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20〜40s，流水冲洗10〜30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇lmin、伊红染液2min、95%乙醇I2min、95%乙醇II2min、100%乙醇I2min、100%乙醇II2min、二甲苯I5min、二甲苯II5min。其中，I、n仅代表处理次数，如二甲苯11Omin、二甲苯n1Omin分别为二甲苯第一次处理lOmin，二甲苯第二次处理lOmin。[0021]所述苏木精染液为：将lg苏木精溶于2〇mL100%乙醇中得甲液，50g钾明硏溶于3〇OmL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馏水定容至l〇〇〇mL;最后加入0.2g碘酸钠，即得。’[0022]所述伊红染液为:将0.¾伊红加入到lOOmL85%乙醇中，溶解完全，即得。[0023]所述HC1-乙醇分化液为:将lmL盐酸加入到99mL7〇%乙醇中，混匀，即得。[0024]本发明的有益效果：[0025]本发明中小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法包括取材、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修整、切片与展片、贴片与烤片、H.E染色、封固等步骤，流程简单，操作方便。同时，该方法可有效去除组织块中的水分，防止石蜡渗透不全;提高透明效果，浸蜡时间相对缩短，可防止组织块脆硬，获得的切片完整，图片结构清晰，为研宄小鲵科动物皮肤结构提供了技术支持，适用于实验室研究工作者对小鲵科动物皮肤组织形态结构的研究。附图说明[0026]图1为实施例1中中国小鲷Hynobiuschinesis皮肤石蜡切片显微图。具体实施方式[0027]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。[0028]实施例1[0029]染液及分化液的配制：[0030]苏木精染液:将lg苏木精溶于20mL100%乙醇中得甲液，50g钾明矾溶于300mL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馏水定容至1000mL;最后加入〇.2g碘酸钠，即得。[0031]伊红染液:将0.5g伊红加入到100mL85%乙醇中，溶解完全，即得。如果染不上色，可加入0•2%的冰醋酸稀释，以促进伊红染色。[0032]HC1-乙醇分化液:将lmL盐酸加入到99mL70%乙醇中，混匀，即得。[0033]本实施例中小鲍科动物中国小鲷Hynobiuschinesis皮肤显微组织切片的制备方法，包括以下步骤：[0034]1取材:在室温下，使用镊子将小鲵科动物背部皮肤夹起，然后使用剪刀剪取所需皮肤，放入10%福尔马林中室温保存，采集的皮肤组织块大小为4mraX4mm，且切面应在一条直线上；[0035]2固定:将采集的皮肤组织投入10%福尔马林固定液或75%酒精固定液）中进行固定，用量为组织块体积的15倍10〜20被均可），并做好标记，便于识别；[0036]3冲洗:将固定后的皮肤组织用水冲洗8min5〜lOmin均可）；[0037]4脱水:在室温下将脱水剂（乙醇用蒸馏水配成不同的梯度浓度，然后将皮肤组织置入，进行逐级脱水，即依次在50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水，其中%%、100%乙醇各重复两次，各级乙醇脱水的时间50min;若步骤3中采用75%酒精固定液固定，则直接加入80%酒精中进行脱水如需过夜，组织块应停留在70%乙醇中）；[0038]⑸透明：透明分两步，第一步采用1〇〇%乙醇和二甲苯按体积比i:1配制的透明液，透明时间为2_5min，第二步采用纯的二甲苯透明液，透明时间为2〇min;[OO39]⑹浸蜡:将已透明的组织放入体积比1:1的二甲苯与石蜡的混合液中25min，然后再分两次放入盛有58°C纯蜡的容器中，每次浸蜡50min，共lOOmin透蜡完毕；[0040]7包埋:在包埋盒内注入融化的石蜡，将已浸蜡的组织块置入其中（使欲切的组织面向下），使蜡块迅速冷却硬固，包埋好的组织块在蜡块中可长期保存；[0041]⑻石蜡块的整修:将包埋盒上石蜡块做适当整修，以节省刀片；[0042]⑼切片与展片:切片厚度5wn，切好片后置于42°c温水中展片；[0043]1〇贴片与烤片:待石蜡切片自然伸展平之后轻轻地从水中捞取，拨正位置，控干水分，然后放入40°C温箱中千燥3h;[0044]llH.E染色:H.E染色按以下流程进行，欲染切片依次置于二甲苯KiOmin—二甲苯II10min—100%酒精I5min—100%酒精n5min—95%酒精（5min—85%酒精5min—75%酒精5min—蒸馏水浸泡5min—苏木精染液（15min—流水冲洗5min—HC1-酒精分化液30s—流水冲洗2〇min—镜检后蒸馏水冲洗2min—70%酒精（lmin—85%酒精（11^11—伊红染液2111111495%酒精12111111495%酒精1121111]14100%酒精I2min—100%酒精n2min—二甲苯I5min—•二甲苯n5min;[0045]12封固：在染色后的皮肤组织边缘滴中性树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，这样树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出，用二甲苯擦干净盖玻片周多余边溢的树胶，将切片放置平稳，稍加重压，待树胶干燥凝固，即得，切片可长期保存。[0046]本实施例中小鲵科动物中国小鲵Hynobiuschinesis皮肤石蜡切片显微图如图1所示，图中Ep为表皮层，SC为致密真皮层，P为色素细胞，M为粘液腺，CV为毛细血管。[0047]注意事项：[0048]1、步骤⑷中脱水处理使用梯度浓度乙醇的作用是利用不同浓度的乙醇逐步脱去组织细胞中的水分，而不至于使组织细胞变形影响观察效果，需要注意的是采用高浓度乙醇脱水时应严格把握时间，以免脱水过度。[0049]2、步骤5中透明处理采用的二甲苯有透明组织的作用，利用二甲苯占据细胞中乙醇位置从而达到透明组织的效果，需要注意的是应时刻注意透明程度且透明适当后立即放入石蜡中。脱水时应注意每级中停留的时间依材料的大小、性质以及固定液的性质而定。[0050]3、步骤5中如果组织块有局部不能透明即有呈白色混浊状态时，则是因脱水不彻底所致，应退回重新脱水，然后再透明。[0051]4、步骤6中浸蜡的作用是利用石蜡与二甲苯互溶的特性，使石蜡占据组织中二甲苯的位置，从而有利于切片。[0052]5、步骤（11中染色过程使用的二甲苯其作用是脱蜡，苏木素染色细胞核，伊红染色细胞质，需要注意的是染色过程须严格把握时间以免功亏一篑。[0053]在本发明的其他实施例中，各步骤中涉及参数的取值可做适当调整，如步骤⑷脱水处理中，各级乙醇脱水时间可在45〜6〇min适当选取，组织块较大时处理6〇min，组织块较小时处理45min，再如步骤5透明处理中，第二步透明的时间可在1〇〜30min适当选取，达到透明效果时即可停止。在给定的范围内适当调整各参数取值为本领域常规技术，此处不再举例说明。

权利要求：1.小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，其特征在于:包括以下步骤：1脱水:将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50%、70%、80%、9〇%、95%、100%的乙醇中脱水，其中95%、100%乙醇各重复两次，每个梯度脱水45〜60min;2透明：将经脱水处理的皮肤组织浸入1〇〇%乙醇与二甲苯的混合液中2〜3min，取出后再浸入二甲苯中10〜30min;所述100%乙醇与二甲苯的体积比为1:1;3浸蜡:将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20~30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45〜6〇min;所述二甲苯与石蜡的体积比为1:1;4将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，gp得;所述切片的厚度为4〜6um，切片后置于42〜45°C的水中展片;所述贴片、烤片为:待切片自然伸展平后从水中取出，控干水分，置于37〜45°C下干燥2~4h，或者于室温下自然干燥一夜；步骤4中所述染色为H.E染色，操作步骤为:将切片依次置于二甲苯IlOmin、二甲苯n101^11、100%乙醇151^11、100%乙醇115111111、95%乙醇511^11、85%乙醇51^11、75%乙醇511^11、水5min、苏木精染液10〜20min，流水冲洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20〜40s，流水冲洗10〜30min，镜检，流水冲洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇lmin、伊红染液2min、95%乙酉孚I2min、95%乙醇n2min、100%乙醇I2min、100%乙醇n2min、二甲苯I5min、二甲苯n5min。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述苏木精染液为:将lg苏木精溶于20mL100%乙醇中得甲液，50g钾明矾溶于300mL蒸馏水中得乙液;将甲液、乙液混合，煮沸2〜3min，再加蒸馈水定容至lOOOmL;最后加入0.2g碘酸钠，即得。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述伊红染液为:将0.5g伊红加入到100mL85%乙醇中，溶解完全，即得。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述HC1-乙醇分化液为:将lmL盐酸加入到99mL70%乙醇中，混匀，即得。

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