申请/专利权人：哈尔滨医科大学

申请日：2017-01-10

公开（公告）日：2017-06-13

公开（公告）号：CN106822171A

主分类号：A61K31/7105(2006.01)I

分类号：A61K31/7105(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.12.03#授权;2017.07.07#实质审查的生效;2017.06.13#公开

摘要：本发明公开了UBC9的反义核苷酸序列在制备抑制癌细胞生长药物中的应用。在本发明中，设计合成了一条UBC9特异性的反义核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用UBC9特异性的反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法降低含双微体的恶性肿瘤细胞中的UBC9表达水平，减少双微体数目，从而达到降低肿瘤细胞的恶性程度，有效抑制恶性肿瘤细胞生长的目的。本发明的提出为针对含双微体的恶性肿瘤细胞的生物治疗提供了新的靶向性治疗方案。

主权项：UBC9Ubiquitin‑conjugating enzyme的反义核苷酸序列在制备减少癌细胞中的双微体数目，同时抑制癌细胞生长并降低癌细胞恶性程度的药物中的应用。

全文数据：UBC9的反义核苷酸序列在制备抑制癌细胞生长药物中的应用技术领域[0001]本发明涉及UBC9的反义核苷酸序列的新用途，具体的，本发明涉及NSMCE2的反义核苷酸序列在制备抑制癌细胞生长药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。背景技术[0002]人类的UBC9基因（Ubiquitin-conjugatingenzyme又名UBE2IDUBC9基因在人类组织和器官中普遍高表达，其在生物体的不同组织和不同发育阶段所发挥的生物学功能不同，该基因的缺失对于生物体来说是致命的。UBC9基因的缺失会导致肿瘤细胞的生长能力和侵袭能力下降，细胞整体的SUMO化水平降低，凋亡细胞的比例增加，细胞出现核内复制和衰老。UBC9基因在恶性肿瘤中的研究已取得了明显的进展，部分的阐明了UBC9基因在肿瘤的发生、发展和预后中的重要作用。[0003]UBC9蛋白参与细胞周期、DNA损伤修复等重要通路的调节，在细胞的生长、分化和凋亡调控等方面起到重要的作用。近年来的研究证明了UBC9蛋白在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等癌症中普遍高表达。UBC9蛋白的这种高表达会通过SUMO化途径和它自身所介导的途径在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用，其作为SUMO化途径中的关键酶也越来越受到关注。[0004]双微体做为肿瘤恶性程度的标志物，在肿瘤细胞的增殖和凋亡等方面发挥着重要的作用，并且双微体上往往携带着大量的MYC基因。[0005]双微体是染色体外癌基因扩增的主要标志物，其为肿瘤恶性程度的标志物，在肿瘤细胞的增殖和凋亡等方面发挥着重要的作用，并且其上通常携带有癌基因和耐药基因，这些基因的异常扩增，往往会导致肿瘤耐药和生长能力增强，与肿瘤细胞的基因组不稳定、恶性程度增加和耐药性密切相关。双微体经常伴随着恶性疾病而产生，并且在实体瘤中的发生率很高。在血液系统瘤和实体瘤中常常伴随着癌基因MYC的异常表达，针对UBC9基因的沉默会抑制MYC基因的表达，进而影响肿瘤细胞的产生。这些提示我们，双微体可能在肿瘤的进化和恶化程度等方面发挥着一定的作用。[0006]针对肿瘤细胞的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，有的放矢，本发明针对与卵巢癌细胞和结直肠腺癌细胞发生发展密切相关的UBC9,用其反义核苷酸序列进行干扰，通过抑制UBC9的表达从而抑制恶性肿瘤细胞生长，针对这一与肿瘤细胞中双微体形成密切相关的重要靶点进行干预，通过减少肿瘤细胞中双微体数目，从而抑制恶性肿瘤细胞的生长。发明内容[0007]本发明针对目前肿瘤治疗效果欠佳的情况，提供一种通过UBC9的反义核苷酸序列干扰UBC9表达，从而抑制含双微体细胞的恶性表型，起到抑制恶性肿瘤细胞的生长的作用。[0008]本发明的技术方案是特异性的针UBC9扩增以其反义核苷酸序列进行RNA干扰，从而抑制含双微体细胞的恶性表型，起到抑制恶性肿瘤细胞的生长的作用。[0009]具体的，本发明采用了以下技术方案：[0010]1、建立稳定转染细胞系[0011]选择含双微体的人卵巢癌细胞UACC-1598-4和人结直肠腺癌细胞⑶L0320DM细胞为研究对象。[0012]1应用Real-timePCR对SUMO化途径中的基因进行筛选；[0013]2然后利用Westernblot在几种肿瘤细胞模型中检测所选基因的蛋白表达水平；[0014]3选择含有双微体的恶性肿瘤细胞系UACC-1598-4和C0L0320DM为本实验所用细胞系；[0015]⑷建立稳定转染psi-U6-shRNA-UBC9基因表达载体的细胞系；[0016]5利用Westernblot检测蛋白沉默效果。[0017]2、抑制UBC9基因表达对双微体产生的影响。[0018]1制备中期染色体核型并分析双微体数目变化情况；[0019]2利用Real-timePCR检测双微体上携带基因的扩增情况；[0020]3、检测UBC9对于双微体稳定存在的影响方式及原因。[0021]⑴利用FISH检测微核排出情况；[0022]⑵抑制UBC9基因表达对细胞DNA损伤的影响；[0023]4、抑制UBC9表达对细胞生物学行为的影响。[0024]⑴绘制细胞生长曲线检细胞增殖能力的变化情况；[0025]2侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化情况。[0026]通过上述研究，本发明发现人卵巢癌细胞UACC-1598-4及人结直肠腺癌细胞系C0L0320DM中抑制UBC9表达后，双微体数目减少、双微体上携带基因扩增水平降低，并且肿瘤细胞恶性程度降低。[0027]因此，在上述研究的基础上，本发明提出了UBC9Ubiquitin-conjugatingenzyme的反义核苷酸序列以及含有所述UBC9的反义核苷酸序列的sh-RNA序列在制备减少癌细胞中的双微体数目，同时抑制癌细胞生长并降低癌细胞恶性程度的药物中的应用。[0028]其中，优选的，所述的UBC9的反义核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0029]其中，优选的，所述的Sh-RNA序列如SEQIDNO.2所示。[0030]其中，优选的，所述的癌细胞为人卵巢癌细胞或人结直肠腺癌细胞。[0031]相较于现有技术，本发明的有益效果在于：[0032]本发明利用UBC9特异性的反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法降低含双微体的恶性肿瘤细胞中UBC9的表达水平，减少双微体数目，降低肿瘤细胞的恶性程度，从而有效抑制恶性肿瘤细胞生长。本发明的提出为针对含双微体的恶性肿瘤细胞的生物治疗提供了新的靶向性治疗方案。附图说明[0033]图1是SUMO化相关基因的表达水平检测；[0034]图2是C0L0320HSRC0L0320DM，UACC-1598-59UACC-1598-4细胞模型中SAE2蛋白表达水平；[0035]㈧SAE2蛋白表达检测；⑶C0L0320HSRC0L0320DM细胞模型中SAE2蛋白表达灰度分析图；（CUACC-1598-59UACC-1598-4细胞模型中SAE2蛋白表达灰度分析图；[0036]图3是C0L0320HSRC0L0320DM，UACC-1598-59UACC-1598-4细胞模型中UBC9蛋白表达水平；[0037]㈧UBC9蛋白表达检测；⑶C0L0320HSRC0L0320DM细胞模型中UBC9蛋白表达灰度分析图；（CUACC-1598-59UACC-1598-4细胞模型中UBC9蛋白表达灰度分析图；[0038]图4是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后蛋白表达情况；（AUBC9蛋白表达检测；（BUBC9蛋白表达灰度分析图；[0039]图5是UACC-1598-4细胞中UBC9基因沉默后其双微体数量变化情况；[0040]㈧核型分析；⑶双微体数量变化分析图；[0041]图6是UACC-1598-4细胞中UBC9基因沉默后高扩增基因的扩增情况；[0042]㈧EIF5A2基因扩增情况；⑶MCL-I基因扩增情况；（CMYCN基因扩增情况；[0043]图7是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后EIF5A2和MYCN蛋白表达情况；[0044]图8是C0L0320DM细胞中沉默UBC9后蛋白表达情况；[0045]㈧UBC9蛋白表达检测；⑶UBC9蛋白表达灰度分析图；[0046]图9是C0L0320DM细胞中UBC9基因沉默后其双微体数量变化情况；[0047]㈧核型分析；⑶双微体数量变化分析图；[0048]图10是C0L0320DM细胞中UBC9基因沉默后高扩增基因的扩增情况；[0049]㈧CDX2基因扩增情况；⑶MYC基因扩增情况；（CFAM84B基因扩增情况；[0050]图11是C0L0320DM细胞中沉默UBC9后CDX2和MYC蛋白表达情况；[0051]图12是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后微核外排情况；[0052]㈧含有及不含有信号的微核；⑶间期细胞带有信号微核的比率；[0053]图13是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后细胞损伤情况；[0054]㈧细胞γ-H2AX信号等级情况；⑶每种γ-H2AX信号等级细胞所占比例情况；（CΥ-Η2ΑΧ蛋白表达情况；[0055]图14是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后细胞的增殖情况；[0056]图15是C0L0320DM细胞中沉默UBC9后细胞的增殖情况；[0057]图16是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9基因后克隆形成情况；[0058]㈧克隆形成情况；⑶克隆数量变化分析图；[0059]图17是UACC-1598-4细胞中沉默UBC9基因后基底膜侵袭情况；[0060]㈧基底膜侵袭情况；⑶细胞侵袭数目变化分析图；[0061]图18是C0L0320DM细胞中沉默UBC9基因后基底膜侵袭情况。[0062]㈧基底膜侵袭情况；⑶细胞侵袭数目变化分析图。具体实施方式[0063]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0064]实施例ISUMO化过程中的相关基因进行筛选[0065]本实施例选择含有稳定存在双微体的恶性肿瘤细胞系C0L0320DM、UACC-1598-4和不含有双微体的细胞系C0L0320HSR、UACC-1598-59作为前期筛选的研究对象。[0066]1、方法[0067]1应用qRT-PCR的方法对SUMO化过程中的相关基因进行筛选：[0068]①RNA的提取[0069]将处于对数生长期的细胞中加入ImlTrizol，在冰上作用5分钟，把细胞吹打下来吸入1.5ml的EP管中。加入0.25ml氯仿，剧烈的震荡30次左右，室温静置5分钟，12000转分，4°C离心15分钟；吸取上层的水相0.5ml到新的EP管中，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，轻轻混匀，室温静置10分钟，12000转分，4°C离心10分钟，弃上清，加入Iml75%的乙醇洗涤沉淀，12000转分，4°C离心10分钟，弃上清，室温干燥15分钟，然后加入20μ1RNase-free水溶解沉淀。[0070]②CDNA的合成[0071]应用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒，按照说明书上的步骤逆转录合成cDNA。[0072]③ReaI-TimePCR[0073]挑选已知SUMO化作用过程中的12个重要基因，检索NCBIUniGene数据库，获得12个基因序列，应用GeneRunner软件设计并合成基因特异性引物（表1。所用引物由Invitrogen公司合成。[0074]表1引物序列[0077]利用的方法计算分析，每个基因的表达水平以hACTB的表达量为内参，与对照组相比，统计分析不同基因的表达水平变化。[0078]⑵利用WesternBlotting方法在细胞模型中检测所选基因的蛋白表达水平：[0079]①蛋白的提取[0080]待细胞生长到对数生长期，贴壁的细胞弃掉原培养液，用预冷的PBS清洗2〜3次后消化，将细胞收集至1.5mlEP管中，3500转分，4°C离心，5分钟；悬浮的细胞直接吹打将含有细胞的培养基转移到IOml离心管中，1600转分，4°C离心，5分钟后弃上清，用Iml的PBS重悬转移至1.5ml的EP管中，3500转分，4°C离心，5分钟。视细胞量加入适量细胞裂解液细胞裂解液:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=9:1:1，涡旋15秒。之后每间隔10分钟涡旋一次，每次15秒，共三次。12000转分，4°C离心，30分钟。收集上清至新的1.5ml离心管中。[0081]②蛋白浓度的测定[0082]利用蛋白质定量试剂盒测量蛋白浓度，计算好实验用量。蛋白也可保存于-80°C备用。[0083]③SDS-PAGE凝胶电泳[0084]本实施例中检测的UBC9蛋白和SAE2蛋白的分子量大小分别为18kDa和90kDa，根据目的蛋白的分子量大小使用浓度分别为15%和10%的分离胶，5%的积层胶进行电泳。[0085]将待测样品加入5X上样电泳缓冲液，混匀，煮沸5分钟，完全冷却后，离心混匀，取等量蛋白样品（50〜IOOyg上样，用80V恒压跑积层胶，待蛋白marker分离出明显的红绿条带时将电压调至120V，进行恒压电泳。电泳的时间根据目的蛋白的分子量决定。[0086]④转膜[0087]待电泳结束后把凝胶放入转膜缓冲液中平衡10分钟。剪取一张与凝胶大小一致的PVDF膜，先放入甲醇中浸泡30秒使其激活，再放入转膜缓冲液中5分钟去除甲醇。按照从负极到正极的顺序依次放好泡沫纤维垫、3层3M滤纸、凝胶、PVDF膜、3层3M滤纸和泡沫纤维垫。排出气泡后封闭转膜装置。300mA恒流冰浴转膜40分钟和100分钟转膜时间由蛋白分子量大小而定）。[0088]⑤封闭[0089]转膜结束后，取出PVDF膜放到杂交盒中，在室温摇床上用0.1%的TBS-T洗三遍，每次5分钟。之后加入适量的封闭液（含10%WesternBlockingReagent的0.1%TBST-T溶液），室温封闭1小时或4°C封闭过夜。[0090]⑥杂交[0091]分别加入适量的按照1:1000稀释的抗UBC9抗体和抗SAE2抗体，4°C杂交过夜或者室温杂交4小时;TBS-T洗膜三次，每次5分钟。之后加入适量的按照1:10000稀释的带有荧光素标记的抗兔抗体，避光，室温杂交1小时。TBS-T洗膜三次，每次5分钟避光）。[0092]⑦检测[0093]利用Odyssey双色红外荧光成像系统扫膜，获取原始图像。调整曝光时间和对比度获得最佳的图像。[0094]2、结果[0095]1应用qRT-PCR的方法对SUMO化过程中的相关基因进行筛选[0096]图1为SUMO化过程中的相关基因的表达水平检测结果，从图1结果可以看出，UBC9基因和SAE2基因在两种不同的细胞模型中显著且稳定高表达。[0097]⑵利用WesternBlotting方法在细胞模型中检测所选基因的蛋白表达水平[0098]图2及图3分别为SAE2基因以及UBC9基因在两种不同的细胞模型中的WesternBlotting检测结果。[0099]从图2及图3结果可以看出，在含双微体较多且稳定存在的细胞C0L0320DM和UACC-1598-4细胞中UBC9蛋白的表达量较不含双微体的细胞C0L0320HSR和UACC-1598-59细胞高，而SAE2的表达水平无明显的差异。[0100]实施例2UBC9反义核苷酸序列对肿瘤细胞中双微体数目以及细胞功能的影响[0101]1、方法[0102]选择含有双微体的恶性肿瘤细胞系UACC-1598-4细胞和C0L0320DM细胞为本实施例所用细胞系：[0103]在含双微体较多且稳定存在的细胞⑶L0320DM和UACC-1598-4细胞中UBC9蛋白的表达量较不含双微体的细胞C0L0320HSR和UACC-1598-59细胞高，而SAE2的表达水平无明显的差异。故选取UBC9基因为本实验的目的基因，UACC-1598-4细胞和⑶L0320DM细胞为本实施例所用的细胞系。[0104]用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在温培养箱中于37°C培养人卵巢癌细胞系UACC-1598-4和人结直肠腺癌细胞系C0L0320DM。[0105]1稳定转染细胞系的建立[0106]①确定嘌呤霉素最佳作用浓度[0107]取对数生长期的UACC-1598-4C0L0320DM细胞接种于12孔板中，接种量以第二天长到80%为最佳。设定嘌呤霉素药物浓度梯度加入孔中，培养一周细胞全部死亡为筛选浓度，确定UACC-1598-4细胞嘌呤霉素最佳筛选浓度为lygml，C0L0320DM细胞嘌呤霉素最佳筛选浓度为8ygml。[0108]②Sh-RNA稳定转染干扰[0109]应用psi-U6RNAi系统构建RNAi沉默表达载体，sh-RNA序列为GATCCGaggaaagcatggaggaaagacTCAAGAGgtctttcctccatgctttcctTTTTTTGGAATTSEQIDNO.2所示），之后进行质粒提取。[0110]将处于对数生长期的UACC-1598-4或C0L0320DM细胞接种于6孔板中，以第二天细胞生长到80%左右为宜。一个EP管中加入1〇μ1转染试剂LipofectamineS;2000TransfectionReagent和250μ1Opti-ΜΕΜ混勾；另一个EP管中加入4yg上述提取得到的质粒和250μ1Opti-MEM，混匀，室温静置5分钟。之后把两个EP管中的液体混合，混匀后室温静置20分钟。将转染复合物均匀的加入到接种细胞的6孔板中。37°C，5%CO2，培养6小时后换成正常的RPMI-1640培养液。24小时之后把原培养液更换为加lygml或8ygml嘌呤霉素的培养液进行稳定筛选。视细胞的死亡情况大约2〜3天更换一次培养液，使用嘌呤霉素稳定筛选一周左右转染干扰质粒的6孔板内仍有细胞存活但是转染空白质粒的6孔板内基本无细胞存活时，便可认为稳定干扰成功），把存活的细胞传入培养瓶内扩大培养。[0111]⑵利用Westernblot检测基因沉默效果[0112]提取沉默UBC9基因的UACC-1598-4和C0L0320DM细胞及对照组总蛋白，方法同实施例1。抗UBC9抗体按照1:1000稀释，抗兔抗体按照1:10000稀释。检测UBC9基因的沉默效果，挑选沉默效果好的实验组做接下来的研究。[0113]3沉默UBC9基因并探究UBC9基因沉默后对双微体产生的影响[0114]1制备中期核型并计数双微体数目：[0115]选取处于对数生长期的细胞，加入秋水仙胺（10〜20ngml，37°C继续培养1〜2小时。之后用胰酶消化，培养液终止消化后吹打混匀，将细胞收集到IOml离心管中，1500转分，离心5分钟。弃上清，弹匀，用ImlPBS重悬，离心，弃上清，弹匀。加入9ml37°C预热的0.075molLKCL溶液，37°C水浴低渗14分钟具体情况视细胞情况而定），逐滴加入Iml新鲜配制的固定液（甲醇:冰乙酸=3:1，轻轻混匀后，1500转分，离心5分钟。弃上清，轻轻弹匀后加IOml固定液，均匀，1500转分，离心5分钟。再重复固定一次（第二次也可4°C固定过夜）。轻轻倒掉上清，根据细胞量滴加适量的固定液。选择合适的高度将细胞悬液滴到4°C预冷的干净载玻片上，室温自然风干。Giemsa染料原液和I3BS按照1:9的比例配置，染色6分钟后，用去离子水冲洗干净，室温晾干。用倒置显微镜观察，拍照并计数双微体数目。核型片子可冻存于-20°C，以备FISH实验所用。[0116]2利用Real-timePCR检测双微体上所携带基因的扩增情况[0117]①细胞基因组DNA提取[0118]选用QIAGEN公司的QIAampDNAExtractKit试剂盒，按照说明书中的实验步骤提取细胞基因组DNA。[0119]取处于对数生长期的细胞，PBS洗两次，之后用胰酶消化，全培养基终止消化，将细胞收集到IOml离心管中，1500转分，离心5分钟。弃上清，弹匀，用ImlPBS重悬，离心，收集细胞至1.5mlEP管中。加200μ1PBS重悬细胞，再加入20μ1QIAGEN酶及200μ1Albuffer，涡旋15秒混匀，56°C水浴10分钟，之后加入200μ1无水乙醇，涡旋15秒混匀。将混合液全部转移到DneasyMinispincolumn中，8000转分，离心1分钟。换新的收集管，加500μ1AWlbuffer，8000转分，离心1分钟。换新的收集管，加500μ1AW2buffer，13000转分，离心3分钟。换新的收集管13000转分，离心1分钟去除AW2bufTer残留。最后将柱子放到1.5ml离心管中，加200μ1高压水，室温静置5分钟。8000转分，离心1分钟，所收集到的液体即为高浓度的基因组DNA。根据实验的需求还可以把柱子放到新的1.5ml离心管中，加200μ1高压水，室温静置5分钟。8000转分，离心1分钟后所收集到的液体即为低浓度的基因组DNA。[0120]②Real-timePCR[0121]已知UACC-1598-4细胞中双微体上携带的高扩增基因分别为MCLUMYCN以及EIF5A2基因；C0L0320DM细胞中双微体携带的高扩增基因为MYC、FAM84B和CDX2。应用Real-timePCR的方法，分别的对双微体上]\0^1、]\^0~4正542、]^：、？41848和0»2基因扩增水平进行检测，引物序列如表2所不。[0122]表2引物序列[0125]⑷检测UBC9对于双微体存在稳定性具有影响作用的具体方式及原因。[0126]1利用FISH检测微核排出情况[0127]①FISH探针标记[0128]探针标记：将提取好的ΙμΐBAC0熟40〜60即^1与4以1随机引物混合，？0?仪上95°C，10分钟。之后立即放在冰上2分钟，使其保持单链状态。加入5μ1荧光素混合物包括1·6μ1缺T的dNTPs、3.2ylCy3GreendUTP和0·2μ1Klenowfragment，混匀后置于37°C水浴中3小时。最后加入ΙμΐStopbuffer终止反应。[0129]探针沉淀：ssDNA9μ1，HumanCotI9μ1，LabeledBACDNA3μ1，加水补齐至50μ1，3molL的醋酸钠5μ1，之后放置-80°C沉淀20分钟。12000转分，离心10分钟。吸去上清切勿碰到沉淀），加入11〇μ1预冷的75%乙醇，12000转分，离心10分钟。小心吸去上清，避光干燥5〜10分钟。[0130]探针溶解:加9μ1杂交液，37°C水浴1〜2小时。[0131]探针变性:75°C水浴8分钟，然后立即置于冰上2分钟。[0132]探针复性:37°C水浴30分钟。[0133]②FISH探针处理[0134]将室温老化2天的中期染色体核型玻片用钻石笔标记好作用区域。置于IXPBS中清洗5分钟，依次在75%、85%和100%的乙醇中脱水各3分钟。作用区域加ΙΟΟμΙRNase工作液（l〇〇ygml，盖上大小正好的PE手套，放入湿盒，37°C孵育40分钟。孵育结束后，将玻片放于2XSSC中清洗3分钟，75%、85%和100%的乙醇中脱水各3分钟。室温干燥。之后在作用区域加1〇〇μ1胃蛋白酶工作液，盖上PE手套，放入湿盒，37°C孵育15分钟。孵育结束后，置于IXPBS中清洗5分钟，1%多聚甲醛固定10分钟，IXPBS中清洗5分钟，75%、85%和100%的乙醇中脱水各3分钟，晾干。将玻片放入75°C预热的70%甲酰胺中，水浴3分钟。立即将玻片放入4°C预冷的2XSSCI和2XSSCII中各3分钟，75%、85%和100%的乙醇中脱水各3分钟。[0135]③FISH杂交流程[0136]每个作用区域加9μ1探针，盖上盖玻片（20mmX20mm,RubberCement胶封片。放入湿盒，37°C孵育48小时。孵育结束后，揭去封片剂，将玻片放入44°C预热的50%甲酰胺中，晃动玻片使盖玻片自然脱落，浸泡15分钟。将玻片放入4°C预冷的2XSSCI和2XSSCII中各3分钟，75%、85%和100%的乙醇中脱水各3分钟，晾干。5μ1DAPI复染，盖玻片24mmX32mm封片。焚光显微镜下观察。[0137]2抑制UBC9基因表达对UACC-1598-4细胞DNA损伤的影响[0138]将20mmX20mm的盖玻片平铺于6孔板中，每个孔中接种IXIO5个细胞。第二天，于显微镜下观察细胞的贴壁状态。吸出培养基，用PBS清洗3次，每次5分钟。洗净PBS后，加入4%的多聚甲醛对细胞固定20分钟。用I3BS清洗3次，每次5分钟。加入2ml0.1%的TritonX-100溶于PBS，4°C孵育10分钟。PBS清洗3次，每次5分钟。加入2ml4%的BSA溶液（溶于PBS，37°C孵育30分钟。然后加入配置好的ΙΟΟμΙ抗体，4°C孵育过夜。孵育结束后，用PBS清洗3次，每次5分钟。加入ΙΟΟμΙ配置好的荧光二抗，37°C孵育1小时。之后I3BS清洗3次，每次5分钟。5μ1DAPI复染，盖玻片封片。荧光显微镜下观察。[0139]3沉默UBC9基因后对细胞功能学的影响[0140]①绘制细胞生长曲线[0141]取处于对数生长期的细胞，将其消化成单细胞悬液，细胞计数后按每孔8000个细胞接种到96孔板中，每种细胞设4个复孔，置于37°C孵箱培养。24小时后，弃掉孔内原培养液，每孔加入1〇〇μ1培养液和20μ1MTS溶液混合物，37°C培养4小时。之后在酶标仪上0D=492nm测量各孔的吸光值。之后每天在相同的时间重复实验，记录并整理实验数据，用GraphPadPrism5绘制细胞生长曲线。[0142]②平板克隆实验[0143]取处于对数生长期的细胞，将其消化成单细胞悬液，细胞计数后按每孔1200、1800个细胞接种于6孔板中，每种细胞设3个复孔，37°C孵箱培养两周左右6孔板中出现肉眼可见克隆且细胞之间无粘连）。弃掉原培养液，PBS洗两遍，之后加入2ml甲醇室温固定15分钟。弃掉固定液，PBS清洗两遍，之后用现配制的Giemsa染液Giemsa染料原液:PBS=1:9染色9分钟，缓慢冲洗掉染液，室温干燥。待6孔板完全干燥后用数码相机拍照，计数后进行统计。[0144]③基底膜侵袭实验[0145]取需要数目的小室放于24孔板中，室温放置一段时间，向24孔板和侵袭小室中加入预热的无血清1640培养基500μ1，37°C孵箱水化2小时。水化后，小心吸出液体，但是不要碰到基底膜。[0146]取处于对数生长期的细胞，将其消化成单细胞悬液，离心，无血清1640培养液重悬细胞，然后进行细胞计数。用含5%FBS的1640培养液将细胞稀释成为3XIO4个ml。向24孔板中加入750μ1含15%FBS的1640培养液，将小室放入24孔板中，但是要避免小室基底膜下产生气泡。迅速向小室中加入500μ1细胞悬液3X104个细胞孔），镜下观察，于37°C孵箱中培养72小时。[0147]取出24孔板，PBS冲洗干净，室温干燥，将膜在无水甲醇中固定1分钟，水洗干净。将Giemsa原液和I3BS按照1:9的比例配置染色液，染色7分钟，水洗干净。用棉签蘸PBS轻轻擦除小室内膜上未穿过膜的细胞。室温晾干，然后用刀片将膜切下，用中性树胶将其固定在载玻片上，盖上盖玻片后在光镜下观察，拍照，计数后进行统计。[0148]2、结果[0149]1稳定转染细胞系的建立[0150]选择UBC9沉默效率在80%以上的细胞系作为后续实验材料使用，稳定转染细胞系的WesternBlotting检测结果和蛋白表达灰度分析图如图4及图8所示。[0151]2稳定转染细胞系的中期核型分析和双微体数量变化[0152]稳定转染细胞系的中期核型分析统计图和双微体数量变化分析图如图5及图9所示，从图5及图9结果可以看出，沉默UBC9基因会导致双微体数目降低。[0153]3Real-timePCR检测双微体上所携带基因的扩增情况[0154]在UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后，高扩增基因EIF5A2、MCL-1和MYCN实时定量PCR以及WesternBlotting检测结果分别如图6及图7所示，从该结果可以看出，在UACC-1598-4细胞中沉默UBC9后，高扩增基因EIF5A2、MCL-1和MYCN的表达水平降低。[0155]在C0L0320DM细胞中沉默UBC9后，高扩增基因MYC、FAM84B和CDX2实时定量PCR以及WesternBlotting检测结果分别如图10及图11所示，从该结果可以看出，在C0L0320DM细胞中沉默UBC9后，高扩增基因MYC、FAM84B和⑶X2的表达水平降低。[0156]⑷沉默UBC9基因后微核外排情况[0157]图12是荧光原位杂交图和荧光原位杂交条形统计图，从该结果可以看出在UACC-1598-4细胞中沉默UBC9基因之后，带有信号微核比例增加。[0158]5抑制UBC9基因表达对UACC-1598-4细胞DNA损伤的影响[0159]图13是免疫荧光实验图、信号比例直方图和WesternBlotting图，从该结果可以看出沉默UBC9基因使细胞DNA损伤减弱。[0160]⑶沉默UBC9基因后对细胞功能学的影响[0161]在UACC-1598-4细胞以及C0L0320DM细胞中沉默UBC9基因后，其细胞生长曲线图分别如图14和15所示，从该结果可以看出，在UACC-1598-4细胞以及⑶L0320DM细胞中沉默UBC9基因后，细胞增殖能力降低。[0162]图16是细胞平板克隆形成实验和克隆数量变化分析图，从该结果可以看出沉默UBC9基因后，细胞的克隆形成能力下降。[0163]图17和图18是细胞基底膜侵袭统实验图和细胞基底膜侵袭统计图，从该结果可以看出沉默UBC9基因后细胞侵袭能力降低。

权利要求：I.UBC9Ubiquitin-conjugatingenzyme的反义核苷酸序列在制备减少癌细胞中的双微体数目，同时抑制癌细胞生长并降低癌细胞恶性程度的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的UBC9的反义核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的癌细胞为人卵巢癌细胞或人结直肠腺癌细胞。4.一种含有UBC9的反义核苷酸序列的sh-RNA序列，其特征在于所述的sh-RNA序列如SEQIDNO.2所示。5.含有UBC9的反义核苷酸序列的sh-RNA序列在制备减少癌细胞中的双微体数目，同时抑制癌细胞生长并降低癌细胞恶性程度的药物中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的sh-RNA序列如SEQIDNO.2所示。7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述的癌细胞为人卵巢癌细胞或人结直肠腺癌细胞。

百度查询： 哈尔滨医科大学 UBC9的反义核苷酸序列在制备抑制癌细胞生长药物中的应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD