申请/专利权人：广西壮族自治区畜牧研究所

申请日：2018-04-18

公开（公告）日：2018-09-28

公开（公告）号：CN108588008A

主分类号：C12N5/073(2010.01)I

分类号：C12N5/073(2010.01)I

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2018.11.23#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明属于基因工程技术领域，公开了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，对供体成纤维细胞进行5‑Aza‑CdR处理72h后发现，适宜浓度0.25μmolL～0.5μmolL的5‑Aza‑CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，分别用不同浓度和不同时间5‑Aza‑CdR处理重构胚，统计其卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数，结果发现20nmolL，72h为最佳处理条件。分析由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5‑Aza‑CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用，确定了分析方法以期达到最佳效果。

主权项：1.一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，其特征在于，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5‑氮杂‑2′‑脱氧胞苷；所述5‑氮杂‑2′‑脱氧胞苷浓度0.25μmolL～0.5μmolL；处理72h。

全文数据：一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用。背景技术[0002]目前，体细胞核移植SCNT技术与基因组学修饰技术的有机结合，为转基因动物的生产、人类基因疾病的动物模型的研制、异种器官移植等基础生物学的研究提供了强有力的技术支撑。由于猪在解剖、组织、生理、营养代谢等方面与人类非常相似，所以被认为是人类异种器官核移植最理想的供者，于是国内外的科学家纷纷将眼光聚焦于SCNT技术与基因组修饰技术的结合。由于大家畜尤其是猪的克隆效率依然很低（1%〜2%，极大地制约了体细胞克隆猪和转基因克隆猪相关研究工作的开展。影响体细胞克隆重构胚早期发育效果的因素有很多，比如供体细胞与受体细胞生长周期的协调，核质融合的过程，以及发育到8-cell阶段后能否顺利完成核质互换，以及重构胚的DNA甲基化与去甲基化水平等均影响到体细胞核移植重构胚的正常发育。对供体细胞和重构胚进行表观遗传修饰处理可以提高核移植胚胎的发育潜能。DNA甲基转移酶抑制剂是广泛运用于体细胞中的表观遗传修饰因子，它的甲基化和去甲基化在SCNT中，对供体与受体基因组重编程具有决定性作用。5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5_Aza_2-deoxycytidine，5_Aza-MR是不可逆的DNA甲基转移酶抑制剂，具有低剂量激活甲基化沉默基因、高剂量致细胞毒性的双重效应。它已通过美国FDA认证，是临床上常用的抗癌药物之一，同时其作为DNA甲基化酶抑制剂被人们所运用。表明用5-Aza-CdR处理供体细胞能够提高牛核移植胚胎在体外发育的潜能。但高浓度的5-Aza-CdR也已经被证实对牛核移植胚胎具有细胞毒性，而低浓度的5-Aza-CdR处理供体细胞有益于猪克隆胚胎的发育。通过研究首先利用5-Aza-CdR处理成纤维细胞供体后发现，高剂量5-Aza-CdR可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，后来发现低剂量可以达到降低甲基化水平同时提高囊胚发育的目的。5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度，无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。[0003]综上所述，现有技术存在的问题是:5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度;若5-Aza-CdR剂量过高可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，分析方法无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。发明内容[0004]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，[0005]本发明是这样实现的，一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5-氮杂-2-脱氧胞苷；[0006]所述5-氮杂-2-脱氧胞苷浓度0.25ymolL〜0.5ymolL;处理72h。[0007]进一步，所述5-氮杂-2-脱氧胞苷的浓度为20nmolL，处理72h。[0008]本发明的另一目的在于提供一种所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物在德保黑猪养殖中的应用。[0009]本发明对供体成纤维细胞进行5-Aza-CdR处理72h后发现，适宜浓度0.25ymolL〜0.5μπι〇1υ的5-Aza-CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，分别用不同浓度和不同时间5-Aza-CdR处理重构胚，统计其卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数，结果发现20nmolL，72h为最佳处理条件。分析由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5-Aza-CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用，确定了分析方法以期达到最佳效果。附图说明[0010]图1是本发明实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法中不同浓度5-Aza-CdR处理重构胚后HMC囊胚的显示图。[0011]图2是本发明实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法不同浓度5-Aza-CdR处理重构胚后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。[0012]图3是本发明实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法5-Aza-CdR处理重构胚不同时间后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。[0013]图4是本发明实施例提供的5-Aza-CdR对重构胚胎体外发育影响的分析方法不同浓度5-Aza-CdR同时处理供体和重构胚后HMC囊胚Hoechst33342染色的显示图。具体实施方式[0014]为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。[0015]下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。[0016]1材料与方法[0017]1.1主要试剂耗材[0018]胎牛血清FBS购置于Gbico公司，TCM-199粉剂、DMEM粉剂购置于美国Gbico公司，激素为eCG，hCG购置于美国Sigma公司，其余的化学试剂如无特殊说明均购置于美国SigmaAldrich公司。细胞融合仪型号:ECM2001，融合槽型号:BTX450，胚胎积聚针型号:DN-10式，卵母细胞成熟培养皿:35_及60_塑料平皿，去核切割刀自制，胚胎培养皿：四孔板。[0019]1.2卵母细胞的成熟培养[0020]卵巢从南宁市的屠宰场获取，装入含有双抗的生理盐水中，用保温壶在4h之内送回实验室。先用普通生理盐水把卵巢冲洗干净，然后加入预热的含双抗的生理盐水，送回胚胎室抽取卵母细胞。用IOmL的注射器抽取卵巢表面2〜6_的卵泡，卵泡液放入试管中静置，弃去上清，留沉淀部分分装。挑选含有3层及以上有颗粒卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体COCs，放入成熟液中（含10IUmLhCG+10IUmLeCG培养，20〜22h后换成不含激素的培养液，继续培养18〜20h至细胞成熟。[0021]1.3胎儿成纤维细胞的培养组织块培养法）[0022]胎猪从南宁市屠宰场获取，置于双抗生理盐水中，4h内送回实验室。先用普通生理盐水清洗三遍，转移至无菌超净台，分离出部分大腿组织，之后用含双抗的PBS清洗2遍，放入60mm的平皿，将其剪碎至2〜3mm的组织块，往培养皿中加入少量含10%FBS的DMEM培养液，用镊子将其均匀铺开，在皿盖作好标记，将其倒扣于培养箱中，4h后加入少量培养液，防止组织块漂浮。24h后在平皿底部加满培养液，48h后继续观察成纤维细胞的生长状况，待成纤维细胞生长至90%左右汇合度时，进行传代，用作猪手工克隆供体细胞。[0023]1.4卵母细胞的去核方法[0024]挑选优质的卵母细胞置于洗卵液中，吹打数次以去除颗粒细胞。然后将其移入链霉蛋白酶溶液中，透明带开始变形时，立即移入含为20%FBS的洗液T20中洗涤，然后放入T20中等其恢复成圆形，用玻璃吸管将卵母细胞转移至切割液含2.5ygmLCB中，挑选恢复完整的卵母细胞用于去核。[0025]极体定位法:挑取第一极体完整的细胞，将极体置于6点或12点的位置，用切割刀切去极体方向约13的卵胞质，去核胞质留做后续试验。[0026]1.5供受体细胞的融合激活[0027]采用一步融合法。融合激活分为三步，首先进行粘合，然后再进行融合电激活，最后进行化学激活。[0028]粘合:先用植物凝集素PHA把无核半卵和供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对物;然后再把另一个去核半卵与配对物相粘合，形成卵-供体-卵式的粘合体，移入电融合液中待融合。[0029]融合电激活:将粘合体均匀放入有电融合液的融合槽中，电融合参数为:AC:6VCm;DC:1.2kVcm，30yS，2DC。电激活后完成后放入培养箱中恢复30min，然后检查其融合情况。[0030]化学激活:将融合后的重构胚放入含5ygmLCB和10ygmLCHX的PZM-3激活液中激活，每滴激活液中放入1枚重构胚，激活4h。[0031]1.6重构胚的微穴培养[0032]为保证无透明带的HMC重构胚能够在相对独立的环境下生长，本研究采用微穴培养法。将激活后的胚胎转移到预先在CO2培养箱中平衡至少4h并且有石蜡油覆盖的PZM-3中的微穴中。微穴的制备：用胚胎聚集针在四孔板底部均匀旋转扎微穴，微穴大小根据试验的要求设置，每个微穴中放入1枚胚胎。48h观察卵裂率，160〜168h观察囊胚率。[0033]1.7囊胚细胞计数[0034]收集第6〜7天的囊胚，于CCM中清洗2〜3次后，置于的ΙΟμπιοΙmLHoechst33342染液，室温中避光染色15min，取出后再用CCM清洗2〜3次，石蜡-凡士林封片，荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。[0035]1.8试验设计[0036]试验一：比较40nmolL，20nmolL，10nmolL，5nmolL，0腦〇1八四种浓度5-厶2-CdR处理HMC重构胚胎72h，对其发育效果的影响；[0037]试验二：比较20nmo1L5-Aza-CdR处理HMC重构胚胎96h，72h，48h，24h，Oh，对其发育效果的影响；[0038]试验三：比较lymolL，0.5ymolL，0.25ymolL，0ymolL四个处理组和重构胚的最佳浓度20nmolL同时处理供体和重构胚，对其发育效果的影响；[0039]1.9数据统计[0040]所得数据由SPSS17.0软件进行统计分析，试验每重复一次均为同一批次试验，在相同来源的卵巢和试验条件下进行试验，所有试验至少重复3次。[0041]2结果分析[0042]2.1不同浓度的5-Aza-CdR处理重构胚对HMC胚胎体外发育的影响[0043]比较40nmolL，20nmolL，10nmolL，5]1111〇11^，〇111]1〇11^四种浓度5-厶2-〇11?处理HMC重构胚72h，对其发育效果的影响，结果表明：5-Aza-CdR处理72h均能提高重构胚的分裂率、桑椹胚率、囊胚率以及囊胚细胞数，就各处理组而言，20nmolL处理组能显著提高囊胚率，lOnmolL和20nmolL处理组均能显著提高囊胚细胞数，而且两组间差异不显著，详见表1，第七天的囊胚发育情况见图I，H〇echst33342染色囊胚细胞见图2。[0044]表1不同浓度5-Aza-CdR处理重构胚对HMC胚胎体外发育的影响[0045][0046]同列不同上标字母表示差异显著P〈0.05。[0047]2.25-Aza-CdR处理重构胚不同时间对HMC胚胎体外发育的影响[0048]利用20nmolL5-Aza-CdR处理HMC重构胚不同时间（96h，72h，48h，24h，0h，统计各时期的胚胎发育情况，发现5-Aza-CdR处理能有效提高重构胚的分裂率、桑椹胚率、囊胚率以及囊胚细胞数，其中72小时处理组能显著提高囊胚率和囊胚细胞数，详见表2,及图3。[0049]表220nmolL5-Aza-CdR处理重构胚不同时间对HMC胚胎体外发育的影响[0050][0052]同列不同上标字母表示差异显著P〈0.05。[0053]2.35-Aza-CdR同时处理供体和重构胚对HMC胚胎体外发育的影响[0054]分别用0ymolL、0.25ymolL、0.5ymolL和lymolL四个处理组和重构胚的最佳浓度20nmolL同时处理供体和重构胚，结果见表3,各处理组重构胚发育率和囊胚总细胞数相对于对照组均无显著提高而甚至降低，分析可能由于同时处理供体和重构胚时，处理的浓度和时间不当对胚胎后期发育造成不利影响，详见表3,图4。[0055]表3不同浓度5-Aza-CdR同时处理供体和重构胚对MHC胚胎体外发育的影响[0056][0057]处理组（供体处理+重构胚处理）：1:0ym〇lL+20nmolL;2:0·25ymolL+20nmolL;3:0·5ymolL+20nmolL;4:lymolL+20nmolL〇[0058]同列不同上标字母表示差异显著P〈0.05。[0059]本发明对供体成纤维细胞进行5-Aza-CdR处理72h后发现，适宜浓度0.25ymolL〜0.5μπι〇1υ的5-Aza-CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，结果发现20nmolL，72h为最佳处理条件，最后用前面所摸索的供体和胚胎的最佳处理条件同时处理后，发现这样的处理对胚胎的发育并没有促进作用，分析可能由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5-Aza-CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用。因此，若要在同时处理时达到降低DNA甲基化水平和提高胚胎发育的目的，则需要在今后的试验中调节各自的处理浓度和时间，以期达到最佳效果。适宜浓度0.25ymolL〜0.5ymolL的5-Aza-CdR处理供体细胞72h以及20nmolL的5-Aza-CdR处理重构胚72h能降低其DNA甲基化水平，并有效提高德保黑猪HMC胚胎的发育潜能。[0060]以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

权利要求：1.一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，其特征在于，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5-氮杂-2-脱氧胞苷；所述5-氮杂-2脱氧胞苷浓度0.25ymolL〜0.5ymolL;处理72h。2.如权利要求1所述的德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，其特征在于，所述5-氮杂-2-脱氧胞苷的浓度为20nmolL，处理72h。3.—种如权利要求1所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物在德保黑猪养殖中的应用。

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