申请/专利权人：江苏先声药业有限公司

申请日：2018-12-28

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN111378671B

主分类号：C12N15/13

分类号：C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2022.08.05#专利申请权的转移;2021.09.14#实质审查的生效;2020.07.07#公开

摘要：本发明涉及一种高通量构建单克隆抗体重组载体的方法以及该方法在高通量抗体发现中的应用，所述的方法包括以下步骤：分选抗原特异性单B细胞到高通量反应容器，并进行高通量逆转录；以获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的PCR扩增；将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至表达载体中；所述的表达载体包含自杀基因ccdB。所述的高通量构建单克隆抗体重组载体的方法可极大地提高重组成功率，从而提高抗体发现的效率，缩短抗体发现时间。

主权项：1.一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法，所述的方法包括以下步骤：1分选抗原特异性单B细胞高通量反应容器，并进行逆转录；2以步骤1获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的PCR巢式扩增，所述巢式扩增为两轮PCR扩增，使用的引物组包括第一轮引物组1和第二轮引物组2，所述的第一轮引物组1包含重链可变区引物组1和轻链可变区引物组1，所述的第二轮引物组2包括重链可变区引物组2和轻链可变区引物组2；所述的重链可变区引物组1包含重链可变区正向引物组1和重链可变区反向引物组1；所述的轻链可变区引物组1包含轻链可变区正向引物组1和轻链可变区反向引物组1；所述的重链可变区引物组2包含重链可变区正向引物组2和重链可变区反向引物组2；所述的轻链可变区引物组2包含轻链可变区正向引物组2和轻链可变区反向引物组2；所述的重链可变区正向引物组1包含编号为LX1、LX2和LX3引物：LX1：AGGAACTGCAGGTGTCC；LX2：CAGCTACAGGTGTCCACTCC；LX3：TGGCAGCARCAGCTACAGG；所述的重链可变区反向引物组1包含编号为NX1的引物：NX1：CAGCTTCCTGCTAATCAGTG；所述的轻链可变区正向引物组1包含编号为LX54、LX55、LX56和LX57的引物：LX54：TGATGACCCARACTCCACT；LX55：CTGCTGCTCTGGGTTCCAGG；LX56：TGGAGTCACAGACYCAGG；LX57：TGCTGCTATGGGTATCTG；所述的轻链可变区反向引物组1包含编号为NX7的引物：NX7：GCACCTCCAGATGTTAACTG；所述的重链可变区正向引物组2包含LX114、LX115、LX116和LX117的引物：LX114：GACAGCAGGAGTGCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG；LX115：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG；LX116：GACAGCAGGAGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCAGG；LX117：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG；所述的重链可变区反向引物组2包含编号为NX12的引物：NX12：GGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG；所述的轻链可变区正向引物组2包含编号为LX142、LX143、LX144和LX145的引物：LX142：GACAGCAGGAGTGCACTCCRRTRTTGTGATGACCCARAC；LX143：GACAGCAGGAGTGCACTCCGATATTGTGATGACBCAGGC；LX144：GACAGCAGGAGTGCACTCCSAAATTGTKCTCACCCAGTC；LX145：GACAGCAGGAGTGCACTCCGACATTGTGMTGACCCAATC；所述的轻链可变区反向引物组2包含编号为NX19和NX20的引物：NX19：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC；NX20：GGGAGCGGCCACGGTCCGTTTTATTTCCAGTCTGGTCCC；其中，序列出现兼并碱基意义如下：R＝AG，Y＝CT，M＝AC，K＝GT，S＝CG，B＝CGT；3将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至重链表达载体和轻链表达载体中；所述的重链或轻链表达载体是在人IgG1表达载体的多克隆位点上包含自杀基因ccdB。

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权利要求：

百度查询： 江苏先声药业有限公司 一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法

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