申请/专利权人：赛业(苏州)生物科技有限公司

申请日：2023-09-16

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN117363660B

主分类号：C12N15/90

分类号：C12N15/90;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12;A01K67/027;A61D19/04;A61K49/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2024.01.26#实质审查的生效;2024.01.09#公开

摘要：本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，公开了一种构建SMA小鼠模型的方法，具体地说，涉及基于同源重组技术的Smn1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。本文公开了包含编码SMN蛋白质的核酸序列的非人动物，所述SMN蛋白质包含人基因序列。本文还公开了包含整体或部分为人的SMN2基因的转基因非人动物。本发明还公开了表达人或人源化SMN蛋白质的非人动物。另外，本发明公开了用于制备和使用包含人或人源化SMN2核酸序列的非人动物的方法。本发明获得的小鼠不再表达小鼠Smn1内源基因，在人源SMN2的调控元件下驱动人SMN2全长序列的转录调控，使得治疗评价中的各类序列可完全靶向人的SMN2序列，可促进脊髓性肌萎缩症的相关科研产业。

主权项：1.一种构建SMA小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：1构建打靶载体I，以野生型C57BL6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；同时合成loxP-Puro-lox511抗性筛选序列；5’端同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr13:100,110,478-100,115,238核苷酸；设计上游引物如SEQIDNO:2所示；下游引物如SEQIDNO:3所示；3’端同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr13:100,138,191-100,141,017核苷酸；设计上游引物如SEQIDNO:4所示，下游引物如SEQIDNO:5所示；所述loxP-Puro-lox511抗性筛选序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；通过INFUION连接将5’端同源臂片段、loxP-Puro-lox511抗性筛选序列和3’端同源臂片段连接至PUC57质粒上，最终获得打靶载体I；2构建Bac载体II，针对BAC:RP11-1012N14进行BAC修饰，在人SMN2基因上游15kb处插入与打靶载体I同向的loxP重组酶位点，在人SMN2基因下游5kb处插入与打靶载体I同向的lox511重组酶位点；且人SMN2基因与lox511之间包含一个Neo抗性筛选元件；3将构建好的打靶载体I电转到C57BL6品系的ES细胞中，细胞经过Puromycin药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞I；4将构建好的Bac载体II电转到ES细胞I中，细胞经过G418药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞II；5将阳性ES细胞II注射入囊胚中，再将囊胚移植到代孕鼠内，通过孕期，小鼠出生；6F0小鼠从毛色观测嵌合率，来判断是否阳性小鼠；7将雄性Founder小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞；8将雄性F1小鼠和雌性F1小鼠相互配种，F2小鼠出生后PCR鉴定，确认纯合子小鼠的出生，获得SMA小鼠模型。

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权利要求：

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