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申请/专利权人：中国科学院水生生物研究所

摘要：本发明公开了一种高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌基因工程菌及构建方法，分别构建自杀型敲除质粒p△hemH1和p△hemH2，所述自杀质粒通过接合的方式进入宿主希瓦氏菌，通过同源重组方式对希瓦氏菌的亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2进行双敲除，同时通过外源添加氯化血红素以维持工程菌的生长，使其大量累积原卟啉PPIX并释放到胞外。

主权项：1.一种高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是同时敲除希瓦氏菌Shewanella oneidensis亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2。

全文数据：一株高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌基因工程菌及构建方法技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双敲除亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2的希瓦氏菌工程菌，所述的工程菌可用于生产原卟啉PPIX。背景技术原卟啉IXPPIX是一个疏水的有机化合物，由4个吡咯基组成，是一个具有共轭体系的卟啉环。它在细胞内呈现的独特环状结构，使其易与部分金属离子配位生成金属卟啉化合物，如铁卟啉、钴卟啉、铜卟啉、锰卟啉，因此具有多样的生物学功能。其中原卟啉IX螫合铁离子形成了血红素ironprotoporphyrinIX,heme，继而与一些蛋白结合形成血红蛋白、过氧化物酶、细胞色素等，在氧气运输、细胞氧化还原反应、电子传递和药物代谢中起了至关重要的作用。因此，原卟啉IX作为血红蛋白合成的前体和重要的酶活性中心，与生命过程密切相关。原卟啉IX的特殊卟啉环结构能够吸收和重新释放特殊的波长，而能产生荧光和活性氧自由基Reactiveoxygenspecies,ROS，因此可以作为光敏剂来诊断和治疗癌症。研究报道原卟啉钠可作为治疗病毒性肝炎的有效药物，它对生物细胞无细胞毒作用，可有效抑制HCV复制子RNA。原卟啉IX的制备通常采用化学合成的方法或者以血红素为原料，通过化学方法去除铁离子，水解成原卟啉IX或其钠盐。但是化学合成的方法，步骤繁琐，产量低，成本高，价格昂贵。而血红素的获得主要从动物血液中提取，同样方法繁琐，会使用到大量化学试剂。随着技术的进步和发展，尽管提取的方法有所改进，但还是依赖于化学试剂的催化及化学反应，但要真正应用于生产需要考虑以下几个问题：1、降低成本。现有的方法成本高、产品单一，没有做到联产其他产品；2、提取的过程中应尽量避免使用毒性较大、难以回收的有机溶剂，做到环保生产。以往的方法普遍的不足是产品纯度低、提取成本高、生产周期长、溶剂回收难等。又由于红血球的血红蛋白中血红素与珠蛋白相连，从血液中提取高纯度产品存在一定难度。2005年，美国有实验室对大肠杆菌进行基因工程改造，过量表达原卟啉IX生物合成的上游基因，可以在胞外分泌少量原卟啉IX，并申请了专利US20050089972A1。而希瓦氏菌含有大量细胞色素由铁卟啉和原细胞色素蛋白组成，具有潜在的生产原卟啉IX的能力，申请人首次通过外源添加氯化血红素的情况下成功双敲除hemH1和hemH2基因，获得高产原卟啉IX的工程菌，并摸索了高产原卟啉IX的最优化条件。该方法与2005年的方法相比，该方法的菌株材料更加具有优势，基因工程改造方法更加简便，产量得到进一步的提高。发明内容本发明的目的在于提供一种希瓦氏菌工程菌及其构建方法，通过同源重组方式对亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2进行双敲除，同时通过外源添加氯化血红素以维持细胞生长，使其大量累积原卟啉PPIX并释放到胞外。本发明的另一个目的在于提供希瓦氏菌工程菌高产原卟啉PPIX的方法，通过外源添加氯化血红素，既可以维持细胞生长，又促使其大量累积原卟啉PPIX，外源氯化血红素的含量的添加和剂量的配比是基因双敲除成功的关键，也是高产原卟啉PPIX的决定因素。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：一株高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌基因工程菌通过下述方法获得：1、将hemH1和hemH2基因的上下游部分片段连接后分别引入重组整合型自杀质粒PDS3.0的多克隆位点，分别得到含有hemH1基因的自杀型敲除质粒p△hemH1和含有hemH2基因的自杀型敲除质粒p△hemH2。该重组的整合型自杀质粒含有庆大霉素抗性基因、蔗糖敏感基因sacB、R6K复制子和多克隆位点。2、将所得自杀质粒转入营养缺陷菌株E.coliWM3064，首先将含有自杀型敲除质粒p△hemH1的WM3064与野生型希瓦氏菌接合，质粒p△hemH1会通过接合的方式进入宿主菌株，依次经过抗生素的筛选获得单交换菌株，再经过无抗性培养基和蔗糖培养基的筛选，最终获得发生双交换的hemH1基因敲除菌株。3、将所得的另外一个含有自杀型敲除质粒p△hemH2的营养缺陷菌株E.coliWM3064与上述hemH1基因敲除菌株接合，同样质粒会经过接合的方式进入宿主，并经过抗生素的筛选获得了单交换菌株，在添加外源氯化血红素的基础上发生双交换时添加，经过无抗性培养基和蔗糖培养基的筛选，同样最终获得了发生双交换的hemH2和hemH1双基因敲除工程菌，该工程菌胞外可以累积大量的原卟啉PPIX。通过上述方法获得的希瓦氏菌工程菌可用于原卟啉生产：在希瓦氏菌工程菌培养过程中添加外源氯化血红素，既可以维持其细胞生长，又促使其大量累积原卟啉PPIX，氯化血红素的添加量优选1～10μgml。进一步地，在实施例选取了含有大量细胞色素的希瓦氏菌MR-1，其具有高产原卟啉PPIX的潜质，在野生型菌株状态下，其胞外并未有原卟啉PPIX的累积，我们通过基因敲除的方法将参与催化原卟啉PPIX与二价铁离子结合形成血红素的两个同源基因hemH1和hemH2进行双敲除，将其潜质挖掘了出来，使其大量累积原卟啉PPIX并释放到胞外。目前为止，国内外并未有对希瓦氏菌的基因hemH1和hemH2双敲除成功的报道，因为血红素是维持细胞呼吸和其他生命活动的重要物质，它的缺失对细胞的生长是致死的，因此我们通过外源添加氯化血红素以维持其细胞生长，又促使其大量累积原卟啉PPIX，这种通过外源添加廉价氯化血红素的方式并最终获得高产原卟啉PPIX的菌株是我们的亮点所在。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、我们对该菌株采用了无痕基因敲除的方法进行基因工程改造，没有引入任何外源基因，不会产生其他附属物质，对人体和其他生物无害。2、我们通过添加了廉价的外源氯化血红素，从而获得了价格高昂、品质高效的原卟啉PPIX，并不需要通过化学合成或者化学萃取的方法获得，该方法更简单、更有效、更安全，原卟啉PPIX直接分泌到胞外，省去了很多繁琐的步骤，实验室检测原卟啉PPIX产量高达80mgL。附图说明图1为基因敲除工程菌构建的电泳检测图。图A为基因hemH1敲除的电泳检测图，图B为基因hemH2敲除的电泳检测图。图2为亚铁螯合酶基因敲除的原理及其流程图。图3为双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的单克隆菌落及其划线扩大培养状态。在含有10μgml氯化血红素的平板上分别得到了双交换的工程菌MR-1ΔhemH1hemH2和双交换的MR-1ΔhemH1，其中MR-1ΔhemH1没有任何表型变化，而MR-1ΔhemH1hemH2不仅表现为克隆偏小，而且表型更加鲜红。图4为野生型菌株S.oneidensisMR-1和双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2在固体培养基静置培养和液体培养基摇瓶培养条件下的表型状况。同等条件下，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2表现为鲜红的表型，液体培养基表面漂浮一层红色物质即原卟啉PPIX，而野生型MR-1则表现为淡粉色表型，培养液表面没有红色物质分泌。图5为不同菌株胞外分泌物的紫外吸收光谱。图A为野生型菌株S.oneidensisMR-1，并未有原卟啉PPIX分泌到胞外，因此未出现最大吸收峰值；图B及图C分别为原卟啉PPIX标准品、双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的吸收光谱，均在405nm左右出现最大峰值，因此判断工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的胞外分泌物可能是原卟啉PPIX。图6为双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2胞外分泌物的质谱检测图。图A为原卟啉PPIX标样的样品及其质谱峰值图，图B为双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2分泌物样品及其质谱峰值图。MR-1ΔhemH1hemH2分泌物的成分与标样的成分基本一致，可判断双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2分泌到胞外的红色物质为原卟啉PPIX。图7为验证外源氯化血红素的添加是维持双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2生长的必要条件。在外源氯化血红素为0μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2不生长，当外源氯化血红素添加量为10μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2生长良好，有原卟啉PPIX在胞外积累。而且两个同源性亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2具有功能互补的特性，均能分别回补双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的表型。图8为外源氯化血红素添加量对MR-1和MR-1ΔhemH1hemH2生长的影响。图9为不同时间及外源氯化血红素添加量对菌株生长速率的影响。图10为外源氯化血红素的添加量对MR-1ΔhemH1hemH2产原卟啉PPIX的影响具体实施方式以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实验指南》NewYork:ColdSpringHarbor实施例1：基因敲除自杀质粒的构建将hemH1和hemH2基因的上下游部分片段连接后分别引入重组整合型自杀质粒PDS3.0的多克隆位点，分别得到含有hemH1基因的自杀型敲除质粒p△hemH1和含有hemH2基因的自杀型敲除质粒p△hemH2。具体操作如下：根据GenBank数据库中野生型希瓦氏菌S.oneidensisMR-1的全基因组序列GCA_000146165.2，分别设计敲除hemH1的引物，引物序列如下：hemH1-sacI-3o:GTgagctcGATGGCGGCAAACGGTATTA含SacI酶切位点hemH1-sacI-3i:agagacgacctaagccagtcGACGACCCGAGGATCACTTAhemH1-sacI-5o:gactggcttaggtcgtctctCCAAGGCGTGAAAAGTGTCGhemH1-sacI-5i:CAgagctcTCGTCGGCCAAAATAGAATA含SacI酶切位点PCR体系：2×MIX25μl、去离子水22μl、F引物1μl、R引物1μl、DNA模板1μl；PCR反应条件：95℃5分钟，95℃30秒，50℃～60℃30秒，72℃30秒～60秒，循环数30～35个，72℃10分钟。根据上述PCR反应体系及条件，利用引物对hemH1-sacI-3ohemH1-sacI-3i进行PCR扩增获得hemH1上游基因片段602bp，序列如SEQIDNO.3所示，利用引物对hemH1-sacI-5ohemH1-sacI-5i进行PCR扩增获得hemH1下游基因片段732bp，序列如SEQIDNO.4所示。以上述获得的hemH1上下游片段为模板，hemH1-sacI-3o和hemH1-sacI-5o为引物，通过融合PCR获得上下游连接的融合片段中间去掉了一部分hemH1基因序列，阅读框发生了变化，融合片段的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，并经过酶切连接进入整合型自杀质粒PDS3.0构建过程请参考Transcriptomicandproteomiccharacterizationofthefurmoduloninthemetal-reducingbacteriumShewanellaoneidensis.JBacteriol.2004；18624:8385–400.doi:10.1128JB.186.24.8385-8400.中，构建基因敲除自杀质粒p△hemH1，并使用PDS3.0通用引物进行扩增并测序验证。sacI酶切体系：10×酶切buffer5μl，DNA44μl，sacI酶1～2μl，37℃过夜酶切反应。连接体系：10×连接buffer1μl，连接酶1μl，sacI酶切的DNA片段2～4μl，sacI酶切的PDS3.0质粒0.5～1μl，去离子水3～5.5μl，16℃过夜连接。根据GenBank数据库中的野生型希瓦氏菌S.oneidensisMR-1的全基因组序列GCA_000146165.2，分别设计敲除hemH2的引物，引物序列如下：hemH2-sacI-3o:GTgagctcACTGCGAGTAATTGTGGTT含SacI酶切位点hemH2-sacI-3i:agagacgacctaagccagtcGGATAGCTTAGCCGTTTGThemH2-sacI-5i:gactggcttaggtcgtctctCGCTCAATGATAATGATGAhemH2-sacI-5o:CAgagctcGATGAACGCTAAAACCGTA含SacI酶切位点PCR反应体系及条件同上，利用引物对hemH2-sacI-3ohemH2-sacI-3i进行PCR扩增获得hemH2上游基因片段715bp，序列如SEQIDNO.6所示，利用引物对hemH2-sacI-5ohemH2-sacI-5i进行PCR扩增获得hemH2下游基因片段551bp，序列如SEQIDNO.7所示。以上述获得的hemH2上下游片段为模板，hemH2-sacI-3o和hemH2-sacI-5o为引物，通过融合PCR获得上下游连接的融合片段中间去掉了一部分hemH2基因序列，阅读框发生了变化，融合片段的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，并经过酶切连接同上进入整合型自杀质粒PDS3.0中，构建基因敲除自杀质粒p△hemH2，并使用PDS3.0通用引物进行扩增并测序验证。实施例2：双基因敲除工程菌株MR-1ΔhemH1hemH2的构建奥奈达希瓦式菌ShewanellaonedensisMR-1最初是从美国纽约州的奥奈达湖厌氧沉积物中分离得到的Bacterialmanganesereductionandgrowthwithmanganeseoxideasthesoleelectron-acceptor.Science.1988；2404857:1319–21.，是革兰氏阴性细菌，属于γ-变形菌门的亚群，具有兼性厌氧的特性，最适生长温度在30℃左右，该菌种已经作为希瓦氏菌的模式菌株，在很多实验室都可以获得，也可以从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。hemH1和hemH2基因敲除的原理及流程示意图如图2所示，具体操作方法如下：首先，将构建好的基因敲除自杀质粒p△hemH1转入营养缺陷菌株E.coliWM3064，该自杀质粒含有R6K复制子，在含有t蛋白的细菌中可以进行复制，而在没有t蛋白的菌株中不能复制，因此当含有自杀型敲除质粒p△hemH1的营养缺陷菌株E.coliWM3064通过接合的方式进入宿主菌株S.oneidensisMR-1，则不能够在该菌株中进行复制，因此整合到该基因组中的同源序列上，由于发生整合的单交换菌株含有抗庆大霉素的基因和蔗糖敏感基因sacB，因此可以在含有15μgml的庆大霉素的LB培养基平板上生长，从而得到了自杀质粒p△hemH1整合进基因组的单交换转化子。其次，将得到的单交换转化子转接于无抗性的基本培养基10gL胰蛋白胨，5gL酵母提取物，5gL氯化钠中试管培养6-8个小时，并涂布于含有10％蔗糖的LB培养基平板上进行第二轮筛选，并将长出的克隆分别对应点到LB培养基平板和含有15μgml庆大霉素的LB培养基平板，并对只在LB培养基平板上生长而不在庆大霉素的LB培养基平板生长的菌落进行PCR扩增，检测获得发生双交换的突变体菌株如图1A，得到小PCR片段的是hemH1基因敲除株，命名为MR-1ΔhemH1。再者，在构建的MR-1ΔhemH1基础上进行hemH2基因的敲除。考虑到血红素是维持细菌生长的必须物质，由于hemH1和hemH2的同时敲除，导致细胞内无法合成血红素，而血红素是维持细胞生长的必须物质，我们通过外源添加氯化血红素，提供细菌生长所需，从而成功敲除了hemH1和hemH2两个基因如图3。将自杀质粒p△hemH2转入营养缺陷菌株E.coliWM3064，再与上述构建的菌株MR-1ΔhemH1接合反应，并涂布在15μgml的庆大霉素的LB培养基平板上生长，从而得到了自杀质粒p△hemH2整合进MR-1ΔhemH1基因组的单交换转化子，将得到的单交换转化子转接于无抗性的基本培养基10gL胰蛋白胨，5gL酵母提取物，5gL氯化钠中试管培养6-8个小时在这里我们加入10μgml的外源氯化血红素，并涂布于含有10％蔗糖和10μgml的外源氯化血红素的LB培养基平板上进行第二轮筛选，得到了双交换的工程菌MR-1ΔhemH1hemH2，表现为克隆偏小，而且表型更加鲜红如图3。PCR扩增检测为小片段DNA如图1B。如图3所示，菌株MR-1ΔhemH1没有任何表型变化，在含有10μgml氯化血红素的平板上得到了双交换的工程菌MR-1ΔhemH1hemH2，表现为克隆偏小，而且表型更加鲜红。如图4所示，在含有10μgml氯化血红素的液体培养条件下，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2表现为鲜红的表型，液体培养基表面漂浮一层红色物质，即原卟啉PPIX，而野生型MR-1则表现为淡粉色表型，培养液表面没有红色物质分泌。实施例3：工程菌株MR-1ΔhemH1hemH2产生的红色物质的化学分析我们分别使用紫外分光光度法和质谱分析的方法对双基因敲除工程菌株MR-1ΔhemH1hemH2产生的红色物质进行定性定量分析，我们将购得的原卟啉PPIX,7,12-diethenyl3,8,13,17-tetramethyl-21II,23II-porphine2,18dipropanoieacid标样及其双基因敲除工程菌株MR-1ΔhemH1hemH2产生的红色物质溶解在90％的丙酮溶液和10％的0.1molL的NH4OH中，使用紫外分光光度计BiowaveII,WPA，用石英比色杯在每隔10nm的波长范围内测量标样和我们的待测样品的吸收峰，从而测得吸收峰曲线，读取其最大吸收峰值，并发现在405nm左右同时出现最大吸收峰如图5。而质谱分析的结果也表明分泌物样品与标品的质谱峰值图相似如图6，证明了双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2分泌物的成分与标样的成分基本一致。实施例4：基因hemH1和hemH2功能互补的特性分析根据GenBank数据库中野生型菌株S.oneidensisMR-1的全基因组序列GCA_000146165.2，分别设计hemH1基因和hemH2基因的引物，其序列如下：MR1-hemH1-F:GTgagctcTATGCGACTGAATGTTAGCC含SacI酶切位点MR1-hemH1-R:GCtctagaTCATTCTGCACTTATCCAAG含XbaI酶切位点MR1-HemH2-F:GgaattcAGAAATGGGTCACGCTGC含EcoRI酶切位点MR1-HemH2-R:GCtctagaGCTTACAGATACGGCTTCACC含XbaI酶切位点PCR获取hemH1基因片段1058bp，获取hemH2基因片段990bp，并分别克隆于pEASY载体上，经测序正确后，SacI和XbaI双酶切回收hemH1片段，EcoRI和XbaI双酶切回收hemH2片段，并分别连接于诱导表达载体pHERD30T，构建质粒pHERD30T-hemH1和pHERD30T-hemH2。将构建好的重组表达质粒转化入营养缺陷菌株E.coliWM3064，并通过接合的方式进入宿主工程菌株MR-1ΔhemH1hemH2中，并经过PCR检测验证。我们发现，当在双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2中分别转入质粒pHERD30T-hemH1和pHERD30T-hemH2后，拯救了双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2在无外源氯化血红素添加的情况下的致死表型，从而恢复野生型MR-1的表型，抑制了PPIX的累计，如图7。因此，基因hemH1和hemH2在功能上是互补的，仅仅敲除其中一个基因或过表达其中一个基因，都可以挽救双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2在无外源氯化血红素情况下的致死特性，并抑制PPIX的累计。只有对MR-1的hemH1及hemH2双基因进行同时敲除，才能获得大量的PPIX累计。目前还未有报道有关希瓦氏菌hemH1及hemH2双基因的成功敲除。实施例5：外源氯化血红素的含量对MR-1ΔhemH1hemH2产PPIX的影响申请人发现当外源氯化血红素含量不断增加时，可以增加双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的生长速度如图8、9，但是却减少了PPIX的累计。当外源氯化血红素含量为0μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2停滞生长，当外源氯化血红素含量达到10μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的生长速度接近野生型MR-1的生长速度。然而，当外源氯化血红素含量为1μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2产PPIX的相对含量最高，约50～80mgL，而当外源氯化血红素含量为100μgml时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2几乎不产PPIX。因此，我们得出结论，当外源氯化血红素的含量达到一定阈值时，双基因敲除工程菌MR-1ΔhemH1hemH2的生长速度和产PPIX的含量趋于稳定，我们摸索出一个最佳的外源氯化血红素添加剂量，约为1～10μgml如图10。序列表110中国科学院水生生物研究所120一株高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌基因工程菌及构建方法1608170SIPOSequenceListing1.021012111005212DNA213人工序列ArtificialSequence4001ttgacttctccctctcctgcgtttggcgtgttattagtaaatcttggtacgcctgatgaa60cccactccgaaagcggttaagcgatttctcaagcagtttttaagtgatcctcgggtcgtc120gatttatccccttggttgtggcaacccattttgcaggggattatcctgaacacccgtcct180aagaaagtcgctaaactttatcaaagtgtgtggacggagcaaggttcgccgttaatggtg240attagtcagtgccaagcccaaaagttggcaacggatttaagcgccacctttaatcagacc300attccggtggaactgggtatgagctatggcaatccttcgattgagagtggctttgccaaa360ctcaaagcccaaggcgccgaacgtatcgtggtgctgccgctgtatccgcagtattcctgc420tcaaccgtcgccagtgtgtttgatgcggtagcgcattatttgactcgcgtgcgtgatata480cctgagctgcgttttaacaagcagtatttcgcccatgaagcctatattgcggcgctggcg540cattcggtaaagcgccattggaaaacccatggtcaggccgagaagctgattttatctttc600cacgggatcccgctgcgctacgcgaccgaaggcgacccatacccagagcagtgccgcacc660accgccaagttattagcgcaggccttaggcttgaccgacggacaatggcaagtatgtttc720caatcccgcttcggtaaagaagagtggttgacgccctatgccgatgagttgctggcggat780ttaccccgccaaggcgtgaaaagtgtcgatgtgatttgccctgcctttgctaccgattgc840cttgaaaccctagaagaaatctcgattggcgcgaaagagaccttcctccatgcaggtggc900gaagcctatcattttattccttgtttgaatgatgatgagctacatatagagctactcagg960ttattagtacaagaacaaacgcagtcttggataagtgcagaatga10052102211984212DNA213人工序列ArtificialSequence4002atgggtcacgctgcgcgtggcaaagttggagtgctgttattaaaccttggcactcctgat60gcgccaacagcatcggcagtaaggcgttatcttgccgagtttttatctgatccacgggtg120gtggaaatcccaaaactcctctggatgctgattttgtatggcatagtacttagggtacgc180cctgcaaagtctgcagcactttatcaaaaggtgtggactgaggcggggtcgccactgatg240gatatcagtttgcgacaaacggctaagctatccgataaattaaccgcggatggtcatcaa300gtttcggttcacttagctatgcgttatggtaatccttctgttgccagcactttacgagag360atgcacaaacaagggattgataagctggtggttttaccgctctatccgcaatatgctgcg420ccgacaactggctcggcttttgacgctatcgctaaagagttatcccaatggcgctacctg480ccatcgctgcattttattaatacttatcacgataaccctgattttattgctgcattagtc540aattcgattcgtgacgattttgataaacatggcaagccgcaaaagttagtgctgtcttac600catggaatgcctgagcgcaatcttcatctgggtgatccatattattgtttttgcatgaag660actactcgtcttgtggctgagcaattaggtttgagcaaagatgaatttgcgatcacattc720caatctcgctttggtaaggccaagtggttgcaaccctatacggatgcaacgatggcggct780ctaccgagtcaaggtgtgcgtgatgtagcgattgtgtgcccagcatttagcgccgattgt840ttagagacgctagaagagattgtcggcgaaaatggccatatctttactcatgcgggggga900gagaagttccgatatattcctgcgctcaatgataatgatgaccacatcgccatgatggcg960aatttggtgaagccgtatctgtaa9842103211602212DNA213人工序列ArtificialSequence4003gatggcggcaaacggtattagcattgatcacgtcatcgaaatcgatgtgccagacgaaga60aatcgttaaacgcatgagcggtcgtcgcgttcaccccggttctggccgtgtttaccacgt120agtattcaatccacctaaagtggaaggcaaggatgacgtgacgggcgaagatttagcgat180tcgtccagacgatgaagaagcgacagtacgtaagcgtttaggtatttaccatgagcaaac240taagccattagttgagtactatggcaaagttgctgcggcgggtaacactcaataccacaa300atttgatggtactcagtcagttgccgcggtgagcgagcagcttgccagcgtgcttaaata360agcacattgcctaaattcgagaacaagttctcatattaagaaaaagcctgcttaagcagg420ctttttttatatgcgactgaatgttagcctgccgtggtatttggctgataaaaggtagca480cattgacttctccctctcctgcgtttggcgtgttattagtaaatcttggtacgcctgatg540aacccactccgaaagcggttaagcgatttctcaagcagtttttaagtgatcctcgggtcg600tc6022104211732212DNA213人工序列ArtificialSequence4004ccaaggcgtgaaaagtgtcgatgtgatttgccctgcctttgctaccgattgccttgaaac60cctagaagaaatctcgattggcgcgaaagagaccttcctccatgcaggtggcgaagccta120tcattttattccttgtttgaatgatgatgagctacatatagagctactcaggttattagt180acaagaacaaacgcagtcttggataagtgcagaatgacggtaaaaaaatctaccgtagaa240gcctgcactcgacctagtttcgtgctgattttatggtagaatctgcgccctttgtggctc300gggagtggatttttggtctctctagcctagactcattatttttaggacacaatgagcgca360cgctcgttgtaatgcccattagcatggatgccaggaaaagagagccactatgaagtttcc420cggtcagcgtaaatcgaaacattattttccggtcaaaacccgagaccccttgctcgagca480attaacgcagcagccccagccctttgccacttatatcagcggtatcgaccaaaccttagt540ggatattgaagctaaagtagaagacgaattgctgagtcgttacggtttacctaaaggcaa600ttcgacgctgatcaatgacgagcaagcacatacactatataccgagctgaaacagaacgg660tttgattagcgatgagtttgccggcggcacgattggcaataccgtgcacaattattctat720tttggccgacga73221052111334212DNA213人工序列ArtificialSequence4005gatggcggcaaacggtattagcattgatcacgtcatcgaaatcgatgtgccagacgaaga60aatcgttaaacgcatgagcggtcgtcgcgttcaccccggttctggccgtgtttaccacgt120agtattcaatccacctaaagtggaaggcaaggatgacgtgacgggcgaagatttagcgat180tcgtccagacgatgaagaagcgacagtacgtaagcgtttaggtatttaccatgagcaaac240taagccattagttgagtactatggcaaagttgctgcggcgggtaacactcaataccacaa300atttgatggtactcagtcagttgccgcggtgagcgagcagcttgccagcgtgcttaaata360agcacattgcctaaattcgagaacaagttctcatattaagaaaaagcctgcttaagcagg420ctttttttatatgcgactgaatgttagcctgccgtggtatttggctgataaaaggtagca480cattgacttctccctctcctgcgtttggcgtgttattagtaaatcttggtacgcctgatg540aacccactccgaaagcggttaagcgatttctcaagcagtttttaagtgatcctcgggtcg600tcccaaggcgtgaaaagtgtcgatgtgatttgccctgcctttgctaccgattgccttgaa660accctagaagaaatctcgattggcgcgaaagagaccttcctccatgcaggtggcgaagcc720tatcattttattccttgtttgaatgatgatgagctacatatagagctactcaggttatta780gtacaagaacaaacgcagtcttggataagtgcagaatgacggtaaaaaaatctaccgtag840aagcctgcactcgacctagtttcgtgctgattttatggtagaatctgcgccctttgtggc900tcgggagtggatttttggtctctctagcctagactcattatttttaggacacaatgagcg960cacgctcgttgtaatgcccattagcatggatgccaggaaaagagagccactatgaagttt1020cccggtcagcgtaaatcgaaacattattttccggtcaaaacccgagaccccttgctcgag1080caattaacgcagcagccccagccctttgccacttatatcagcggtatcgaccaaacctta1140gtggatattgaagctaaagtagaagacgaattgctgagtcgttacggtttacctaaaggc1200aattcgacgctgatcaatgacgagcaagcacatacactatataccgagctgaaacagaac1260ggtttgattagcgatgagtttgccggcggcacgattggcaataccgtgcacaattattct1320attttggccgacga13342106211715212DNA213人工序列ArtificialSequence4006actgcgagtaattgtggttatacatcacaatttaaagcgcttgaagcactccataaagaa60tataaagacaaaggcttggtggtgattggttttccttcggatgattttttccaagaggaa120aacgacgaaaaagacaccgctaaagtatgctacatcaactatggtgtcaccttcactatg180ctcgcgacgtctcctgtgagggggagtgatgttaatagtgtattcaagtatttaggtgat240aaagccggtgcacctaaatggaatttctacaaatatgtggtcagtggcgatggcaacact300gtgatgcaatttaattctaaggttaaacccgatagcactgagcttaagcaggcaatagaa360tccgtgctgtaatgcctaaaatttttcatttacttatttttaagaggctactttggctag420gttttcaggattatcaaaagaaatgggtcacgctgcgcgtggcgctcaatgataatgatg480accacatcgccatgatggcgaatttggtgaagccgtatctgtaagcttgagtcatattat540agaaaaggatagcaacggctatccttttgttttttttaagcattaatcaatcaccaaaat600gattttcaaaataactttcgataatcagtaccgcagaaaccgcatcgacttgaccttttg660ttagcgctttataaccacctaattcaaagagtctggcttttgcatctgtggtggt7152107211551212DNA213人工序列ArtificialSequence4007tagtctttcatcttgggtgaaaattttaacgccaaactttgcgttaagtcggttggcaaa60ttttctcgccctgtgggtcatttcttgctctgtaccatccatgttgagcggtaaaccgac120gaccactaaatcgggttgccactcttggatgagttttgcgatttcttcccaatttggaat180gccatcaacggctttgatagataaaagt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权利要求：1.一种高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是同时敲除希瓦氏菌Shewanellaoneidensis亚铁螯合酶基因hemH1和hemH2。2.根据权利要求1所述的希瓦氏菌工程菌，其特征在于，敲除的基因hemH1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，敲除的基因hemH2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的希瓦氏菌工程菌，其特征在于，所述的希瓦氏菌为希瓦氏菌S.oneidensisMR-1。4.权利要求1所述希瓦氏菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：1将基因hemH1和hemH2的上下游片段连接后分别引入重组整合型自杀质粒PDS3.0的多克隆位点，得到自杀型敲除质粒p△hemH1和p△hemH2；2将含有自杀型敲除质粒p△hemH1的营养缺陷菌株E.coliWM3064与野生型希瓦氏菌接合，自杀质粒p△hemH1通过接合的方式进入宿主希瓦氏菌，通过同源重组的方式获得hemH1基因敲除菌株；3将含有自杀型敲除质粒p△hemH2的营养缺陷菌株E.coliWM3064与上述hemH1基因敲除菌株接合，自杀质粒p△hemH2通过接合的方式进入宿主，且在接合后发生双交换时添加外源氯化血红素，利用同源重组的方法最终获得双基因敲除工程菌。5.权利要求1所述希瓦氏菌工程菌在生产原卟啉中的应用。6.根据权利要求4所述的构建方法或权利要求5所述的应用，其特征在于，在希瓦氏菌工程菌培养过程中外源氯化血红素的添加量为1～10μgml。

百度查询： 中国科学院水生生物研究所 一株高产原卟啉PPIX的希瓦氏菌基因工程菌及构建方法