买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：杰克逊实验室

摘要：本文记载了根据本发明的方面鉴定调节iRhom多肽活性的化合物的方法，所述方法包括使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及测定所述化合物对所述iRhom多肽活性的影响。检测到所述iRhom多肽的蛋白水解活性的降低表明所述化合物能够在受试者中发挥以下作用中的一种或多种：降低肿瘤生长、降低肿瘤进展、治疗癌症和促进毛发生长；检测到所述iRhom多肽的蛋白水解活性的增加表明所述化合物能够在受试者中加速伤口愈合。

主权项：一种鉴定调节iRhom多肽的活性的化合物的方法，其包括：使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响。

全文数据：鉴定改变iRhom多肽活性的化合物的方法及其用途[0001]相关申请的引用[0002]本申请要求于2014年5月9日提交的美国临时专利申请No.61991,423和于2014年5月12日提交的美国临时专利申请No.61992，152的优先权，所述临时专利申请的全部内容以引用的方式纳入本文。[0003]基金信息[0004]本发明是在由国立卫生研究院所授予的基金如.0六034196、见077642和01057199的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。技术领域[0005]本文总体上记载了用于鉴定改变iRhom多肽活性的化合物的方法及其用途。根据具体的方面，本文公开了用于鉴定调节iRhom多肽的蛋白水解活性例如，增大、刺激、降低、抑制或消除iRhom多肽的蛋白水解活性的化合物的方法，以及其用途。背景技术[0006]菱形蛋白酶rhomboidprotease是几乎存在于所有物种中的酶家族。菱形蛋白酶是膜内丝氨酸蛋白酶，菱形蛋白酶的蛋白水解裂解作用对细胞调控是重要的。膜内蛋白酶的活性位点埋在细胞膜的脂双层中，并且它们在其他跨膜蛋白的跨膜结构域内裂解这些跨月吴蛋白。[0007]无活性的菱形蛋白酶（iRhom是高度保守的膜内蛋白。在本发明的发现之前，人们认为iRhom由于在推定的活性位点缺少丝氨酸残基而无蛋白水解活性。发明内容[0008]一方面，本发明基于以下发现：iRhom是短寿命蛋白，但是显性突变增加它们的蛋白稳定性并刺激不依赖于金属蛋白酶活性的特定的EGF家族配体双调蛋白的分泌。另一方面，本发明基于以下发现:哺乳动物iRhom在调节EGFR信号传导事件中发挥作用，所述EGFR信号传导事件促进伤口加速愈合并引发肿瘤发生。另一方面，本发明至少部分基于以下发现:iRhom能够与金属蛋白酶并行调节EGFR信号传导，并且在受损的伤口愈合和癌症中可用作治疗靶标。[0009]一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物激活iRhom多肽对底物的蛋白水解活性，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加表明所述化合物激活了iRhom多肽对底物的蛋白水解活性。[0010]另一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中加速伤口愈合或组织修复，所述方法包括：使表达iRhom多肽和EGFR配体的细胞与测试化合物接触;b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加；以及c测定细胞分泌的EGFR配体相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加和细胞分泌的EGFR配体的增加表明所述化合物能够加速伤口愈合。[0011]另一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽的胞质结构域，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触;b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加表明所述化合物抑制iRhom多肽的胞质结构域。[0012]在一个实施方案中，所述方法还提供了通过分析暴露于所述化合物后iRhom多肽的半衰期来测定iRhom多肽稳定性的增加。[0013]在一些实施方案中，所述底物是EGFR配体或EGF样底物。[0014]在另一个实施方案中，通过检测EGFR配体分泌的增加来测定iRhom多肽稳定性的增加。在另一个实施方案中，通过检测可溶性EGFR配体水平的增加来测定iRhom多肽稳定性的增加。在一些实施方案中，所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0015]在另一个实施方案中，通过检测EGFR信号传导活性的增加来测定iRhom多肽稳定性的增加。[0016]在另一个实施方案中，本发明的化合物抑制iRhom多肽和蛋白酶体之间的相互作用。[0017]在另一个实施方案中，所述化合物使iRhom多肽的胞质结构域失活。在一些实施方案中，所述胞质结构域的失活是短暂的。[0018]在一个实施方案中，本发明的化合物使iRhom多肽的胞质结构域裂解和或缺失，以使所述多肽具有蛋白水解活性或改变的生物活性。在一些实施方案中，小鼠iRhom2在第1至268位氨基酸残基之间被裂解，或人iRhom2在第1至298位氨基酸残基之间被裂解。在其他实施方案中，小鼠iRhoml在第1至272位氨基酸残基之间被裂解，或人iRhoml在第1至316位氨基酸残基之间被裂解。在另一个实施方案中，所述化合物激活iRhom多肽的肽酶域。[0019]在一个实施方案中，所述iRhom多肽是iRhoml或iRhom2。在另一个实施方案中，所述iRhom多肽是人或小鼠iRhom多肽。[0020]在一个实施方案中，本发明的化合物选自小分子、肽或多肽诱饵decoy。在另一个实施方案中，所述化合物连接至细胞穿透肽。在另一个实施方案中，所述化合物是细胞可透过性的。在另一个实施方案中，所述化合物是泛素蛋白酶抑制剂。[0021]在一个实施方案中，本发明的化合物加速角化细胞的迀移。在另一个实施方案中，所述化合物加速成纤维细胞的增殖。[0022]一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽对底物的蛋白水解活性，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及b测定iRhom多肽的生理靶标的分泌相对于合适对照的减少，或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽对底物的蛋白水解活性。[0023]另一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中降低肿瘤生长和或进展或治疗癌症，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及b测定iRhom多肽的生理靶标的分泌相对于合适对照的减少，或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物能够在受试者中降低肿瘤生长和或进展或治疗癌症。[0024]另一方面，本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中促进毛发生长，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及b测定iRhom多肽的生理靶标的分泌相对于合适对照的减少，或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物能够在受试者中促进毛发生长。[0025]在一个实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是上皮癌。在其他实施方案中，所述癌症是食管癌、肺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴腺癌或膀胱癌。[0026]在一个实施方案中，所述底物是EGFR配体或EGF样底物。[0027]在另一个实施方案中，通过检测iRhom多肽的生理革E1标分泌的减少来测定对iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。在一些实施方案中，所述iRhom多肽的生理靶标是EGFR配体。在一个实施方案中，通过检测可溶性EGFR配体水平的下降来测定对iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。在其他实施方案中，所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0028]在一个实施方案中，通过检测EGFR活性的降低来测定对iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。[0029]在另一个实施方案中，所述化合物抑制iRhom多肽的肽酶域。[0030]在另一个实施方案中，所述化合物通过使iRhom多肽肽酶域的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活来影响iRhom多肽的活性。在一个实施方案中，所述iRhom多肽是小鼠iRhom2，并且所述化合物使小鼠iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第635位组氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位组氨酸。在其他实施方案中，所述iRhom多肽是人iRhom2，并且所述化合物使人iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第664位组氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位组氨酸。[0031]在一个实施方案中，iRhom家族成员是iRhoml或iRhom2。在其他实施方案中，iRhom家族成员是人或小鼠iRhom家族成员。[0032]在一个实施方案中，本发明的化合物选自小分子、多肽诱饵、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、反义分子、特异性针对Rhbdf2的核酶；或编码miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的多聚核苷酸;或其各自的生物等价物。在其他实施方案中，所述化合物连接至细胞穿透肽。在一些实施方案中，所述化合物是细胞可透过性的。[0033]-方面，本发明提供了分离的多肽，其包含变体iRhom多肽。[0034]另一方面，本发明提供了分离的多肽，其包含缺失细胞溶质N-末端结构域的人iRhom2〇[0035]另一方面，本发明提供了分离的多肽，其包含缺失细胞溶质N-末端结构域的小鼠iRhom2〇[0036]另一方面，本发明提供了分离的小鼠iRh〇m2多肽，其在小鼠iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基处包含突变，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第635位组氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位组氨酸。[0037]另一方面，本发明提供了分离的人iRhom2多肽，其在人iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基处包含突变，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第664位组氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位组氨酸。[0038]在一个实施方案中，本发明提供了编码上述多肽中任一种的分离的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含上述核酸分子的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达上述载体的宿主细胞。附图说明[0039]图1A是示出了使用本文所述的增殖测定对MEF进行定量的图；以X轴所示的数目接种细胞并孵育细胞24h，荧光程度与总细胞DNA的量成比例;数据以平均值±s.d.表示；[0040]图1B是示出了使用本文所述的划痕（scratch-wound试验对cubcubmcubmcub和++mCubmcubMEF的迀移进行定量的图；在时间点0时测量划痕伤口的宽度（100%开口），以初始宽度的百分数计算在各时间点伤口闭合的增加;数据以平均值±s.d.表示；[0041]图1C是不出了对cubcubmcubmcub或++mcubmcubMEF的EGFR信号传导的多个标记物的免疫印迹分析的图像，其中一式两份地测定run细胞裂解物，使用肌动蛋白充当内参照（loadingcontrol;[0042]图ID示出了在受伤后第0、7、14、21和28天，6-40周龄雌性cubcubmcubmcub和++mCUbmCUb小鼠组n=3中再生耳组织的代表性图像。[0043]图1E是示出了对图1D中所示的耳孔闭合的定量的图；数据以平均值±s.d.表示；[0044]图1F不出了在受伤后第0、7和14天，cubcubmcubmcub和++mcubmcub小鼠的耳横截面的图像，用苏木精曙红进行染色原始放大率，X10;注意cubcubmcubmcub小鼠的耳中未分化且增厚的表皮E10-12个有核层）以及广泛程度的增殖M;虚线表示切开的部位；[0045]图2A是示出了cub突变为小鼠Rhbdf2基因中12681bp缺失的图，其中所述缺失开始于外显子1和2的中间并且包含外显子2-6,在外显子6之后随即结束；[0046]图213不出了使用外显子2、5、12和19的引物对++1113111311131113、+311131113111311131113和cubcubmcubmcub小鼠的MEF进行逆转录酶PCR的结果图；ntc代表无模板对照；[0047]图2C示出了使用针对所示外显子边界的TaqMan基因表达测定，对从皮肤组织提取的cDNA进行qPCR的结果图，使用肌动蛋白充当内参照（endogenouscontrol;将数据标准化为++mCUbmCUb肌动蛋白水平，使用4种生物复制品，一式三份地测定样品；数据以平均值土s.d.表示；[0048]图2D示出了使用常规TaqMan基因表达测定检测具有外显子1-外显子7边界的转录物的qPCR结果图；使用3种生物复制品，一式三份地测定样品（各柱代表单独的小鼠）；数据以平均值土s.d.表示；[0049]图2E是瞬时表达Flag标记的HuWt人全长RHBDF2cDNA和HuCub人类版本的cubcDNA的HEK293细胞的抗Flag免疫印迹的图像，使用肌动蛋白作为内参照；[0050]图2F示出了使用Flag特异性抗体染色的表达Flag标记的HuWt和HuCub的B6原代MEF的代表性图像，DAPI用于对细胞核进行复染色;箭头代表全长蛋白和突变蛋白的细胞质表达；[0051]图3A是示出了KOMPRhbdf2敲除小鼠中野生型产物的PCR结果的图像，预期产物长度为2181bp;L代表从NewEnglandBiolabs获得的lkbDNA梯状标记物（ladder，ntc代表无模板对照；[0052]图3B示出了对Rhbdf2表达的报告基因的分析的图像;全胚胎whole-mountX-gal染色的E18.5Rhbdf2--胚胎示出了表皮中P-gal的强表达箭簇）（原始放大率，X2.5，X-gal染色的两周龄雌性Rhbdf2+皮肤示出了毛囊内鞘层和外鞘层中的P-gal阳性箭头）（原始放大率，X5;毛干中未观察到染色；比例尺，1mm;[0053]图3C是示出了具有Rhbdf2无效突变的小鼠缺少再生表型的图，如与Rhbdf2cubA：ub小鼠相比，6至8周龄雌性Rhbdf2+小鼠的耳中显著延缓的伤口闭合所显示的；[0054]图3D示出了证明了具有Rhbdf2无效突变的小鼠具有正常的皮肤和毛发形态的图像;在所示的创伤后时间点获取的来自Rhbdf2eulVeul^PRhbdf2+小鼠的成年皮肤的H&E染色切片，其中成年Rhbdf2eulVeub皮肤显示出薄的皮下脂肪层F、异常的毛囊⑶、厚的表皮E、增大的皮脂腺SG、致密的交织排列的胶原纤维束C，以及毛囊和毛球的不完全分化HF;成年Rhbdf2+皮肤显示出正常表皮和毛囊；比例尺，lOOwn;原始放大率，X10和X40;[0055]图3E是示出了Rhbdf2-A小鼠发育出正常的毛皮箭簇），而复合突变的Rhbdf2-Aub小鼠表现出稀疏的毛皮箭头的图像；[0056]图4A是示出了Mcub是T至G点突变的图，所述点突变破坏了Areg基因中的正常供体剪接位点外显子1，导致使用可变的下游剪接位点；[0057]图4B是示出了在28天中6-8周龄雌性Rhbdf2++Areg++、Rhbdf2cubcubAreg++和Rhbdf2cubcubAregMcubMcub小鼠中耳孔的愈合组n=3只小鼠）的图；数据以平均值土s.d.表不；[0058]图4C示出了苏木精曙红染色的切片图，其示出了Rhbdf2culVc:ubAregMculVMcub小鼠耳孔切开后的愈合，其中虚线表示切开部位;原始放大率，X10;E代表表皮，M代表增殖;与图1F进行比较；[0059]图4D是示出了同龄的Rhbdf2++Areg++、Rhbdf2cubcubAreg++和Rhbdf2cubcubAregM™b»fcUb雌性小鼠中血清仙即水平的图，其中在他^^社2™b™bAregM™bM™b小鼠的血清中未检测到AREGn.d.;数据以三次独立实验的平均值土s.d.表示;#*p〈0.001;[0060]图4E是对从Rhbdf2++Areg++、Rhbdf2cub⑶bAreg++和Rhbdf2cub⑶bAregMcubM⑶M、鼠中分离的培养的小鼠表皮角化细胞MEK的上清液中AREG水平的ELISA定量的图，其中在Rhbdf2cubMlbAregMculVMc:ub小鼠的MEK中未检测到AREGn.d.;数据以三次独立实验的平均值土s.d.表示;***p〈0.001;[0061]图4F是示出了从EGFR配体的qPCR获得的结果：使用TaqMan基因表达测定，从Rhbdf2cubA：ubAregvlPRhbdf2+AAregv%皮肤组织提取cDNA，使用肌动蛋白充当内参照；将数据标准化为Rhbdf2+AAreg+A肌动蛋白水平，数据以三次独立实验的平均值±s.d.表示；*p〈0.05;[0062]图5A是示出了全长人RHBDF2HuWt基因和模拟小鼠Rhbdf2cubS因的人构建体HuCub的示意图；[0063]图5B是示出了在293T细胞中共表达HuWt或HuCub与AREG基因后，对经裂解的AREG的ELISA定量的图；转染后24h，用DMSO或10yM马立马司他MM孵育细胞24h，并在条件培养基中分析AREG水平，重复进行转染并将条件培养基稀释5倍。[0064]图5C是示出了对所示基因型的8-12周龄雌性小鼠进行LPS注射后3h，通过ELISA对血清TNFa水平进行定量的图，其中在没有进行LPS注射的Rhbdf2++小鼠的血清中未检测到TNFan.d.；*p50%嵌合性的雄性与B6白化病雌性交配;通过PCR对黑色后代进行基因分型。使杂合体相互交配以产生纯合体，或使杂合体与Rhbdf2eubA；ub小鼠交配以产生Rhbdf27euM、鼠。Jackson实验室的动物保护与使用委员会批准了全部实验操作。[0259]细胞培养和试剂一一如之前所述我们分离了MEF。根据制造商的说明书CELLnTECZenbio，ResearchTrianglePark，NC分离小鼠表皮角化细胞MEK。使细胞生长在37°C、含有5%⑶2的增湿室中。分别从FisherScientificBoston，MA和Zen-BioResearchTrianglePark，NC购买MEF试剂[磷酸盐缓冲溶液PBS、HyCloneDulbeccosModifiedEagles培养基、高葡萄糖DMEM、青霉素-链霉素和HyClone胎牛血清]和MEK试剂（祖细胞靶向培养基CnT-07、抗生素抗真菌溶液ABM和蛋白酶Dispase。从LifetechnologiesChicago，IL获得TrypLETMSelect。使293T和C0S7细胞分别生长在DMEM和RPMI培养基中。[0260]组织学一一如之前所述制备用于组织学检查的组织。[0261]耳孔闭合:使用外科手术用的耳打孔装置NapoxKN-292B使小鼠受伤以在左耳中央制造2mm通孔，并在28天期间分析闭合率。在所示的时间点，使小鼠安乐死并使用4X物镜OlympusBX41显微镜捕获耳孔及周围组织的图像。ImageJ软件分析受伤区域。在室温下将耳固定在10%中性缓冲福尔马林NBF中24h并进行石蜡包埋和切片处理。在第0天测量物理创伤面积并将在所有随后时间点的测量值计算为初始面积的百分数。[0262]增殖和划痕测定:使用MEF进行这两组测定。对于增殖测定，在37°C使所示数目的细胞生长在胶原包被的96孔板中。孵育24h之后，移除生长培养基并在-80°C冷冻平板直至使用。使用CyQUANT®细胞增殖试剂盒测定相对细胞数目（Lifetechnologies。使用Victor3多标记孔板读数仪PerkinElmer，Boston，MA测量焚光强度。对于划痕测定，使MEF在胶原包被的6孔板中生长至汇合，并通过将无菌p200吸管端拉过孔从汇合的单层除去一条细胞。使用ZeissObserver相差显微镜上的5X物镜和AxioVision4.6.3软件在0、3、6、9和12h时获取划痕图像。使用GRID插件，我们在每个图像上覆盖了网格。所述网格大小使至少10条线等分划痕图像。汇集各划痕的宽度并计算平均值。用ImageJ软件分析来自0、3、6、9和12h时间序列的捕获图像。[0263]人AREG、HB-EGF和EGFELISA:在被接种于24孔板的293T细胞中进行瞬时转染。使用脂质体LTX以及Plus试剂，将16.5fmolHuWt或HuCub与25ngAREG或50ngHB-EGF或200ngEGF共转染。使每个孔中转染的DNA总量与pCMV6-AC-HA载体等量。24h之后，用溶于lml新鲜培养基的DMSO或10yMMM替换旧培养基。24h之后，将lOOyl上清液不稀释HB-EGF和EGF或稀释5倍AREG，并根据制造商的说明书进行ELISADY262、DY259和DY236。[0264]从OriGeneRockville，MD获得包含编码人AREGRC203150、人HB-EGFSC108485、人EGFSC127840、人RHBDF2RC203923、小鼠RhbdflMC205414和人RHBDL2RC219882的cDNA的表达质粒。根据制造商的说明书使用QuikChangeIIXL诱变试剂盒AgilentTechnologies，SantaClara，CA在全长RHBDF2或小鼠Rhbdfl中引入突变缺失或插入），并通过DNA测序来验证。使用引物设计程序（QuikChange®PrimerDesign，AgilentTechnologies产生用于定向诱变的引物。[0265]免疫化学:使铺在BDBioCoat™胶原I2-孔培养载片中的MEF生长至约60%汇合，并根据制造商的说明书用Lipofectamine™LTXLifetechnologies瞬时转染。48h之后，将MEF固定在丙酮中并进行免疫细胞化学。简言之，在-20°C将于IX冰冷的PBS中冲洗的细胞固定在丙酮中l〇min，然后在PBS中再冲洗3次。用3%H2〇2阻断内源过氧化酶活性，然后在阻断缓冲液PBST，10%山羊血清和1%BSA中孵育lh，并在4°C下在DDK特异性抗体Origene中过夜孵育。第二天，将细胞在PBST中冲洗25min，并在室温下在HRP缀合的二级抗体中孵育30min。在PBST中冲洗三次之后，将细胞在DAPI溶液（IHCWorld，Woodstock，MD中孵育10min，然后覆盖盖玻片并密封载玻片。从AbeamCambridge，MA获得妈联蛋白和giatin抗体。从Lifetechnologies获得二级抗体。[0266]免疫沉淀:根据制造商的说明书Lifetechnologies进行293T和C0S7细胞转染。用400lil包含完全小蛋白酶抑制剂RocheAppliedScience，Indianapolis，IN的细胞裂解缓冲液（Cel1Signaling，Danvers，MA处理铺在6孔板中的细胞，将细胞在冰上孵育10min并在冷室中以14,000g离心10min。在冷室中，在振荡平台上将细胞上清液和20yl与抗DDK抗体Origene缀合的磁珠孵育过夜。过夜孵育之后，将磁珠浆体用TBS-T冲洗三次，使用2XSDS-PAGE上样缓冲液收集蛋白质。[0267]SDS-PAGE和免疫印迹:将细胞用冰冷的roS冲洗一次并用包含完全小蛋白酶抑制剂（RocheAppliedScience，Indianapolis，IN的RIPA缓冲液（CellSignaling，Danvers，MA在冰上孵育10min。在4°C将细胞裂解物以14,000g离心10min。收集上清液并贮存于-80°〇直至进一步使用。使用Qubit焚光计Lifetechnologies对蛋白总量进行定量，并将lOy区蛋白上样到4-12%预制凝胶（1^〇]123,411611^16，即）上，在140¥下运行直至低分子量Precisionplus蛋白标准品（Bio-Rad到达凝胶底部。使用iBLOTLifetechnologies将已分开的蛋白质通过电泳转移至PVDF膜上，然后在室温下在溶于TBST20mMTris、137mM氯化钠和0.1%Tween_20的5%BSACellSignalingTechnology中封闭lh。然后在4°C将膜在一级抗体（1:1000中孵育过夜，然后在TBST中冲洗三次每次15min，然后在室温下在二级抗体（1:2000中孵育lh。在TBST中再冲洗90min之后，将膜暴露于SuperSignalWestFemtoSubstrateFisherScientific5min以检测辣根过氧化物酶产生的信号。用肌动蛋白特异性抗体对膜进行预探测。所有的抗体购自CellSignalingTechnologyDanvers，MAqDDK抗体购自OrigeneRockville，MD。[0268]原代MEF中的双调蛋白沉默：鼠AregshRNA克隆TRCN0000089050在慢病毒载体pLKO•1中）和pLKO•1中的scramble对照shRNA质粒#1864分别获得自SigmaAldrichSt•Louis，M0和AddgeneCambridge，MA。使用质粒pMDLgpRRE、pRSV_rev和pMD2•gAddgene在293T17细胞ATCC中产生慢病毒粒子。在48h和60h时收集慢病毒上清液，合并上清液并通过0.45M1PVDF过滤器过滤。在5μgml聚凝胺的存在下，连续两天用慢病毒上清液感染MEF两次，然后用嘌呤霉素2iigml选择72小时，之后用于下游实验。[0269]息肉计数和肿瘤面积一一对从12周龄的被安乐死的小鼠中摘除的肠道进行冲洗并将其固定于10%中性缓冲福尔马林中至少24h，进行息肉计数或组织学检查。使用数字扫描仪NanoZoomer2.OHTHamamatsu，Japan扫描H&E染色的载片。在解剖显微镜下对息肉直接计数或从扫描的数字图像进行计数。值得注意的是，所述两种方法之间息肉计数无显著差异。还使用NanoZoomer2.0HT软件从扫描的数字图像测量肿瘤面积。[0270]定量实时PCRqPCR--使用TRIZOl®P1usRNA纯化试剂盒（LifeTechnologies，Chicago,IL，根据制造商的说明书从皮肤分离纯化的RNA。用Agilent2100生物分析仪测定纯化的RNA的质量。之前已公开了qPCR循环条件。我们从LifeTechnologiesChicago,IL获得以下预设计的TaqMan基因表达测定的列表，表1。[0271][0272]小鼠TNFa和AREGELISA--对于小鼠TNFaELISA，对8-12周龄的所示基因型的雌性小鼠静脉注射70yg来自大肠杆菌0111:B4的脂多糖Sigma-Aldrich，St.Louis，M0Jh之后收集血清并冷冻于-80°C。对于AREGELISA，将从所有基因型采集的血清立即使用或在-20°C贮存不超过24h。根据制造商的说明书，使用DuoSetELISADevelopmental试剂盒R&DSystems，Minneapolis，MN对样品进行测定（DY989和DY410。[0273]流式细胞术--使用Lipofectamine™LTX试剂，用600ngHuWt或HuCub或HuWtP.I186TcDNA瞬时转染铺于6孔板中的293T和C0S7细胞。40h之后，在150μgml环己酰胺中孵育细胞〇、〇.5、1、2和处。之后，在室温下将细胞固定于15^1新鲜制备的冰冷的4%??八中40min。用2mlPBST冲洗细胞一次并在室温下在黑暗中将细胞重悬于150ylTOST中。再次冲洗后，将细胞重悬于在冰上的包含藻红蛋白标记的抗DDK-级抗体（1:50的125ylTOST中30min。最后一次冲洗之后，将细胞重悬于FACS缓冲液并进行流式细胞术分析（BDFACSCalibur〇[0274]逆转录酶PCRRT-PCR-一根据制造商的方案使用[0275]RNAqueousTM_4PCRAmbion从MEF中提取RNA。使用逆转录酶（Promega逆转录系统，Promega从lugRNA合成cDNA。使用特异性引物以及HotMasterTAQ5_PrimeInc.扩增cDNA。[0276]统计学分析--使用GraphPadPrismv4GraphPadSoftware，SanDiego，CA产生Kaplan-Meier存活曲线并计算蛋白质半衰期单相指数衰减方程）。用单因素AN0VA和t-检验测定统计学上的差异。小于0.05P值的被认为是统计学上显著的。[0277]项[0278]1.一种鉴定化合物的方法，所述化合物激活iRhom多肽对底物的蛋白水解活性，所述方法包括：[0279]a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及[0280]b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加表明所述化合物激活iRhom多肽对底物的蛋白水解活性。[0281]2.第1项的方法，其中通过分析暴露于所述化合物之后iRhom多肽的半衰期来测定iRhom多肽稳定性的增加。[0282]3.第1项的方法，其中所述底物是EGFR配体或EGF样底物。[0283]4.第1项的方法，其中通过检测EGFR配体分泌的增加来测定所述iRhom多肽稳定性的增加。[0284]5.第4项的方法，其中所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0285]6.第1项的方法，其中通过检测可溶性EGFR配体水平的提高来测定iRhom多肽稳定性的增加。[0286]7.第6项的方法，其中所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0287]8.第1项的方法，其中通过检测EGFR信号传导活性来测定iRhom多肽稳定性的增加。[0288]9.第1项的方法，其中所述化合物抑制iRhom多肽和蛋白酶体之间的相互作用。[0289]10.第1项的方法，其中所述化合物使iRhom多肽的胞质结构域失活。[0290]11.第10项的方法，其中所述胞质结构域的失活是短暂的。[0291]12.第1项的方法，其中所述化合物使iRhom多肽的胞质结构域裂解和或缺失，以使所述多肽具有蛋白水解活性或改变的生物活性。[0292]13.第12项的方法，其中小鼠iRhom2在第1和268位氨基酸残基之间被裂解，或人iRhom2在第1和298位氨基酸残基之间被裂解。[0293]14.第12项的方法，其中小鼠iRhoml在第1和272位氨基酸残基之间被裂解，或人iRhoml在第1和316位氨基酸残基之间被裂解。[0294]15.第1项的方法，其中所述化合物激活iRhom多肽的肽酶域。[0295]16.第1-15项中任一项的方法，其中所述iRhom多肽是iRhoml或iRhom2。[0296]17.第15项的方法，其中所述iRhom多肽是人或小鼠iRhom多肽。[0297]18.第1项的方法，其中所述化合物选自小分子、肽或多肽诱饵。[0298]19.第18项的方法，其中所述化合物连接至细胞穿透肽。[0299]20.第1项的方法，其中所述化合物加速角化细胞的迀移。[0300]21.第1项的方法，其中所述化合物加速成纤维细胞的增殖。[0301]22.第1项的方法，其中所述化合物是细胞可透过性的。[0302]23.第1项的方法，其中所述化合物是泛素蛋白酶抑制剂。[0303]24.-种鉴定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽对底物的蛋白水解活性，所述方法包括：[0304]a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触;和[0305]b测定iRhom多肽的生理靶标的分泌相对于合适对照的减少，或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽对底物的蛋白水解活性。[0306]25.第25项的方法，其中所述底物是EGFR配体或EGF样底物。[0307]26.第24项的方法，其中通过检测iRh〇m多肽的生理靶标分泌的减少来测定对iRhom多肽蛋白水解活性的抑制。[0308]27.第26项的方法，其中所述iRhom多肽的生理靶标是EGFR配体。[0309]28.第27项的方法，其中所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0310]29.第24项的方法，其中通过检测可溶性EGFR配体水平的降低来测定对iRhom多肽蛋白水解活性的抑制。[0311]30.第29项的方法，其中所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN。[0312]31.第24项的方法，其中通过检测EGFR活性的降低来测定对iRhom多肽的蛋白水解活性的抑制。[0313]32.第24项的方法，其中所述化合物抑制iRhom多肽的肽酶域。[0314]33.第24项的方法，其中所述化合物通过使iRhom多肽肽酶域的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活来影响iRhom多肽的活性。[0315]34.第33项的方法，其中所述iRhom多肽是小鼠iRhom2并且所述化合物使小鼠iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第635位组氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位组氨酸。[0316]35.第33项的方法，其中所述iRhom多肽是人iRhom2并且所述化合物使人iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基失活，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第664位组氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、跨膜螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位组氨酸。[0317]36.第24-33项中任一项的方法，其中所述iRhom家族成员为iRhoml或iRhom2。[0318]37.第33项的方法，其中所述iRhom家族成员是人或小鼠iRhom家族成员。[0319]38.第24项的方法，其中所述化合物选自小分子、肽或多肽诱饵。[0320]39.第38项的方法，其中所述化合物连接至细胞穿透肽。[0321]40.第24项的方法，其中所述化合物是细胞可透过性的。[0322]41.-种鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中加速伤口愈合或组织修复，所述方法包括:a使表达iRhom多肽和EGFR配体的细胞与测试化合物接触;b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加；和c测定细胞分泌的EGFR配体相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加和细胞分泌的EGFR配体的增加表明所述化合物能够加速伤口愈合。[0323]42.第41项的方法，其中所述iRhom家族成员是iRhoml或iRhom2。[0324]43.第41项的方法，其中所述iRhom家族成员是人或小鼠iRhom家族成员。[0325]44.-种鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中降低肿瘤生长和或进展或治疗癌症，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触;和b测定iRhom多肽的生理靶标的分泌相对于合适对照的减少或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物能够在受试者中降低肿瘤生长和或进展或治疗癌症。[0326]45.第44项的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。[0327]46.第44项的方法，其中所述癌症是上皮癌。[0328]47.第44项的方法，其中所述癌症是食管癌、肺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴腺癌或膀胱癌。[0329]48.-种鉴定化合物的方法，所述化合物抑制iRhom多肽的胞质结构域，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触;b测定iRhom多肽稳定性相对于合适对照的增加，其中iRhom多肽稳定性的增加表明所述化合物抑制iRhom多肽的胞质结构域。[0330]49.第44-48项中任一项的方法，其中所述iRhom家族成员是iRhoml或iRhom2。[0331]50.第44-48项中任一项的方法，其中所述iRhom家族成员是人或小鼠iRhom家族成员。[0332]51.第41项的方法，其中所述化合物选自小分子、多肽诱饵、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、反义分子、特异性针对Rhbdf2的核酶；或编码miRNA、siRNA、shRNA、dsRNA的多聚核苷酸;或其各自的生物等价物。[0333]52.-种分离的多肽，其包含变体iRhom多肽。[0334]53.-种分离的多肽，其包含细胞溶质N-末端结构域缺失的人iRhom2。[0335]54.-种分离的多肽，其包含细胞溶质N-末端结构域缺失的小鼠iRhom2。[0336]55.-种分离的小鼠iRhom2多肽，其在小鼠iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基处包含突变，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第635位组氨酸、TM螺旋4上的第695位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第701位半胱氨酸和TM螺旋6上的第744位组氨酸。[0337]56.-种分离的人iRhom2多肽，其在人iRhom2的蛋白水解位点中的一个或多个氨基酸残基处包含突变，所述氨基酸残基选自TM螺旋2上的第664位组氨酸、TM螺旋4上的第724位谷氨酰胺、TM螺旋4上的第730位半胱氨酸和TM螺旋6上的第773位组氨酸。[0338]57.-种分离的核酸分子，其编码第52-56项中任一项的多肽。[0339]58.-种载体，其包含第57项的核酸分子。[0340]59.-种宿主细胞，其表达第58项的载体。[0341]60.-种鉴定化合物的方法，所述化合物能够在受试者中促进毛发生长，所述方法包括:a使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；和b测定iRhom多肽的生理祀标的分泌相对于合适对照的减少或EGFR活性相对于合适对照的降低，其中iRhom多肽的生理靶标分泌的减少或EGFR活性的降低表明所述化合物能够在受试者中促进毛发生长。[0342]序列[0343]小鼠iRhom2蛋白序列全长SEQIDN0:1[0344]MASADKNGSNLPSVSGSRLQSRKPPNLSITIPPPESQAPGEQDSMLPERRKNPAYLKSVSLQEPRGRWQEGAEKRPGFRRQASLSQSIRKSTAQWFGVSGDWEGKRQNWHRRSLHHCSVHYGRLKASCQRELELPSQEVPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPDEVDRPHAAHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRISVAHMSFQAAAALLKGRSVLDATGQRCRHVKRSFAYPSFLEEDAVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYffLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGffHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSffQLLERPffKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLWLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH[0345]Rhbdf2cub小鼠突变SEQIDN0:2[0346]MSSMPDDVFESPPLSASYFRGVPHSASPVSPDGVHIPLKEYSGGRALGPGTQRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHIIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLKNRGVYESVKYIQQENFWIGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDQQIEQLVRRERDIERTSGCCVQNDRSGCIQTLKKDCSETLATFVKWQNDTGPSDKSDLSQKQPSAVVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKffPICTEQAQSNHTGLLHIDCKIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEDATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRIWLSLFLHAGIVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRISIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSffQLLERPffKAFFNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGMLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLVFAGLFASLVLffLYIYPINWPWIEYLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH[0347]小鼠iRhoml蛋白序列全长SEQIDN0:3[0348]MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPAAVPPAAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETARVPSPHHEPRRLVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVIRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRMADDTADGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFNRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALVKGRSIRDGTLRRGQRRSFTPASFLEEDMVDFPDELDTSFFAREGVLHEEMSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVffVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSffQILARPffRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPffIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH[0349]小鼠iRhomlN-末端截短的蛋白序列（等价于Rhbdf2eub突变一一无细胞溶质结构域但保留跨膜肽酶域SEQIDN0:4[0350]MSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPDQADLTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGGPLAPQPKVRLRQEVVSAAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSYVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRKRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFILAAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSKEECSSTLAVffVKWPVHPSAPDLAGNKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKSSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSVCFQMTVLRDLEKLAGffHRIAIIYLLSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSffQILARPffRAFFKLLAVVLFLFAFGLLPWIDNFAHISGFVSGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYFYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH[0351]人iRhom2蛋白序列全长SEQIDN0:5[0352]MASADKNGGSVSSVSSSRLQSRKPPNLSITIPPPEKETQAPGEQDSMLPEGFQNRRLKKSQPRTWAAHTTACPPSFLPKRKNPAYLKSVSLQEPRSRWQESSEKRPGFRRQASLSQSIRKGAAQWFGVSGDffEGQRQQffQRRSLHHCSMRYGRLKASCQRDLELPSQEAPSFQGTESPKPCKMPKIVDPLARGRAFRHPEEMDRPHAPHPPLTPGVLSLTSFTSVRSGYSHLPRRKRMSVAHMSLQAAAALLKGRSVLDATGQRCRVVKRSFAFPSFLEEDVVDGADTFDSSFFSKEEMSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKWPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLffLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSffPLLERPffKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLffLYIYPINWPfflEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH[0353]人截短的iRhom2等价于Rhbdf2eub突变一一无细胞溶质结构域但保留跨膜肽酶域）SEQIDN0:6[0354]MSSMPDDVFESPPLSASYFRGIPHSASPVSPDGVQIPLKEYGRAPVPGPRRGKRIASKVKHFAFDRKKRHYGLGVVGNWLNRSYRRSISSTVQRQLESFDSHRPYFTYWLTFVHVIITLLVICTYGIAPVGFAQHVTTQLVLRNKGVYESVKYIQQENFWVGPSSIDLIHLGAKFSPCIRKDGQIEQLVLRERDLERDSGCCVQNDHSGCIQTQRKDCSETLATFVKWQDDTGPPMDKSDLGQKRTSGAVCHQDPRTCEEPASSGAHIWPDDITKffPICTEQARSNHTGFLHMDCEIKGRPCCIGTKGSCEITTREYCEFMHGYFHEEATLCSQVHCLDKVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGVVHCLVSVVFQMTILRDLEKLAGWHRIAIIFILSGITGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGLLACLFVELFQSffPLLERPffKAFLNLSAIVLFLFICGLLPWIDNIAHIFGFLSGLLLAFAFLPYITFGTSDKYRKRALILVSLLAFAGLFAALVLffLYIYPINWPWIEHLTCFPFTSRFCEKYELDQVLH[0355]人iRhoml蛋白序列全长SEQIDN0:7[0356]MSEARRDSTSSLQRKKPPWLKLDIPSAVPLTAEEPSFLQPLRRQAFLRSVSMPAETAHISSPHHELRRPVLQRQTSITQTIRRGTADWFGVSKDSDSTQKWQRKSIRHCSQRYGKLKPQVLRELDLPSQDNVSLTSTETPPPLYVGPCQLGMQKIIDPLARGRAFRVADDTAEGLSAPHTPVTPGAASLCSFSSSRSGFHRLPRRRKRESVAKMSFRAAAALMKGRSVRDGTFRRAQRRSFTPASFLEEDTTDFPDELDTSFFAREGILHEELSTYPDEVFESPSEAALKDWEKAPEQAD[0357]LTGGALDRSELERSHLMLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGWHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSffQILARPffRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPffIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEffCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH[0358]人iRhomlN-末端截短的蛋白序列（等价于Rhbdf2eub突变一一无细胞溶质结构域但保留跨膜肽酶域SEQIDN0:8[0359]MLPLERGWRKQKEGAAAPQPKVRLRQEVVSTAGPRRGQRIAVPVRKLFAREKRPYGLGMVGRLTNRTYRKRIDSFVKRQIEDMDDHRPFFTYWLTFVHSLVTILAVCIYGIAPVGFSQHETVDSVLRNRGVYENVKYVQQENFWIGPSSEALIHLGAKFSPCMRQDPQVHSFIRSAREREKHSACCVRNDRSGCVQTSEEECSSTLAVWVKWPIHPSAPELAGHKRQFGSVCHQDPRVCDEPSSEDPHEWPEDITKWPICTKNSAGNHTNHPHMDCVITGRPCCIGTKGRCEITSREYCDFMRGYFHEEATLCSQVHCMDDVCGLLPFLNPEVPDQFYRLWLSLFLHAGILHCLVSICFQMTVLRDLEKLAGffHRIAIIYLLSGVTGNLASAIFLPYRAEVGPAGSQFGILACLFVELFQSffQILARPffRAFFKLLAVVLFLFTFGLLPWIDNFAHISGFISGLFLSFAFLPYISFGKFDLYRKRCQIIIFQVVFLGLLAGLVVLFYVYPVRCEWCEFLTCIPFTDKFCEKYELDAQLH[0360][0361][0362][0363][0364][0365][0366][0367]本领域技术人员会理解或仅使用常规实验即能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意欲包含于以下权利要求中。

权利要求：1.一种鉴定调节iRhom多肽的活性的化合物的方法，其包括：使表达iRhom多肽的细胞与测试化合物接触；以及测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响。2.权利要求1的方法，其中测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响包括测定所述iRhom多肽相比于合适对照的稳定性。3.权利要求1的方法，其中测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响包括测定所述iRhom多肽相比于合适对照的生理靶标的分泌水平。4.权利要求1的方法，其中测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响包括测定相对于合适对照的EGFR活性的水平。5.权利要求1的方法，其中测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响包括测定相比于合适对照的可溶性EGFR配体的水平。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述iRhom多肽的活性是裂解底物的蛋白水解活性。7.权利要求1的方法，其中测定所述测试化合物对iRhom多肽的活性的影响包括检测相比于合适对照iRhom多肽通过蛋白水解裂解底物的蛋白水解活性。8.权利要求2的方法，其中所述iRhom多肽稳定性的降低表明所述化合物降低所述iRhom多肽的蛋白水解活性，并且其中所述iRhom多肽稳定性的增加表明所述化合物增加所述iRhom多肽的蛋白水解活性。9.权利要求3的方法，其中所述iRhom多肽的生理靶标分泌的增加表明所述化合物增加iRhom多肽的蛋白水解活性，并且其中所述iRhom多肽的生理靶标分泌的减少表明所述化合物抑制iRhom多肽的蛋白水解活性。10.权利要求4的方法，其中EGFR活性的增加表明所述化合物增加iRhom多肽通过蛋白水解裂解底物的蛋白水解活性，并且其中EGFR活性的降低表明所述化合物抑制iRhom多肽的蛋白水解活性。11.权利要求5的方法，其中可溶性EGFR配体的增加表明所述化合物增加iRhom多肽的蛋白水解活性，并且其中可溶性EGFR配体的减少表明所述化合物抑制iRhom多肽的蛋白水解活性。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述iRhom多肽的蛋白水解活性的降低表明所述化合物能够在受试者中发挥以下作用中的一种或多种:降低肿瘤生长、降低肿瘤进展、治疗癌症和促进毛发生长;并且所述iRhom多肽的蛋白水解活性的增加表明所述化合物能够在受试者中加速伤口愈合。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述细胞表达EGFR配体。14.权利要求6、7或10的方法，其中所述底物是EGFR配体或EGF样底物。15.权利要求3或9的方法，其中所述生理靶标是EGFR配体。16.权利要求5、11、13、14或15的方法，其中所述EGFR配体选自AREG、HB-EGF、TGFa和EPGN〇17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述细胞在体外。18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述iRhom多肽是iRhom1或iRhom2。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述iRhom多肽是人iRhom或小鼠iRhom。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述测试化合物选自小分子、肽、多肽诱饵、miRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、dsRNA分子、反义分子、特异性针对Rhbdf2的核酶;或编码11^1?嫩、811?祖、8111?嫩、181?祖的多聚核苷酸;其任意两种或更多种的组合；以及其任意一种或多种的生物等价物。21.基本上如本文所示或所述的鉴定调节iRhom多肽活性的化合物的方法。

百度查询： 杰克逊实验室 鉴定改变iRhom多肽活性的化合物的方法及其用途