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申请/专利权人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院;青海大学

摘要：本发明提供了一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用，属于生物技术和基因治疗技术领域。本发明经实验发现：SENP1蛋白能促进心肌细胞的增殖和迁移，抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的心肌细胞死亡、ROS聚集及形态学改变，促进HIF‑1α和ACSL4在mRNA和蛋白质水平的表达，促进VEGF的表达。SENP1蛋白具有调控心肌细胞铁死亡的作用，对于多种病因引起的心肌细胞铁死亡的保护具有重要意义。

主权项：1.一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

全文数据：一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用技术领域本发明属于生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。背景技术各种心血管疾病均可导致机体发生缺氧，低氧可进一步影响心肌细胞的增殖、分化和死亡，在心肌细胞中产生很多严重的负作用并导致细胞进行性丢失进而加重心血管疾病最终引起心力衰竭。心肌细胞的死亡可导致心肌细胞丢失，是导致各种心血管疾病的重要病理学特征。心肌细胞的死亡方式包括细胞凋亡、坏死和自噬等不同形式，它们共同调控程序性细胞死亡，不仅在心脏的稳态中起关键作用，而且在心血管疾病的发病机制中也发挥重要作用。在非致死性应激或损伤的条件下，程序性心肌细胞死亡是影响心脏细胞命运和病理变化的主要因素。其中坏死被认为是在严重的心肌损伤和应激反应中发生的偶然的、未调节的、不可逆的过程，表现为细胞肿胀、细胞膜和细胞器破坏、细胞裂解。程序性坏死在肿瘤、神经退行性疾病、病原体感染和心脏病在内的多种细胞死亡和炎性疾病中发挥重要作用。目前，已报道的程序性坏死主要包括坏死性凋亡、焦亡、MPT-依赖性坏死、铁死亡、PARP-1依赖性细胞死亡和NETosis等。其中铁死亡是一种铁依赖的、氧化反应驱动的新的程序性坏死，不同于凋亡、自噬等其他形式的细胞死亡。铁死亡可发生在缺血的心肌细胞中导致心肌细胞丢失，并被证实与急性心肌梗死、缺血再灌注损伤、心力衰竭等心血管疾病密切相关。类泛素SmallUbiquitin-likeModifier，SUMO化修饰是一种动态可逆的蛋白质翻译后的修饰过程，参与调控多种生物学过程。类泛素特异性蛋白酶1SUMO-specificcysteineproteases，SENP1是一种主要的去SUMO化酶，可以将SUMO蛋白从其靶蛋白上去除。研究证实SENP1可增加低氧诱导因子1αhypoxia-induciblefactor1alpha，HIF-1α的转录活性和稳定性，在低氧应答反应中扮演关键的角色，同时SENP1HIF-1α反馈还被证实在低氧诱导的肿瘤细胞增殖、侵袭、上皮间质转化中具有调节作用。发明内容本发明的目的在于提供一种SENP1基因和或SENP1蛋白的新用途，探索缺血性心脏病治疗的新靶点。本发明提供了一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本发明还提供了包括所述SENP1基因的病毒载体、质粒、重组细胞或组合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本发明还提供了包括所述SENP1蛋白的重组细胞和或组合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。优选的，所述心血管疾病包括急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤和心力衰竭中的一种或者多种。有益效果：本发明提供了一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本发明通过研究SENP1对心肌细胞增殖和迁移的影响以及对铁死亡诱导剂erastin诱导的心肌细胞铁死亡的调控作用，最终发现：SENP1能促进心肌细胞增殖和迁移，部分抑制erastin导致的心肌细胞死亡、形态变化和ROS聚集，促进HIF-1α、ACSL4和血管内皮生长因子vascularendothelialgrowthfactor，VEGF的表达；干涉HIF-1α可下调SENP1的表达。SENP1抑制erastin诱导的心肌细胞发生铁死亡的过程可能是通过SENP1调控HIF-1α、ACSL4的去SUMO化修饰来实现的。附图说明图1为本发明实施例2所述SENP1对H9c2细胞增殖的影响结果图。其中，Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图2为本发明实施例2所述SENP1对H9c2细胞迁移的影响划痕实验结果图。其中，图2-A为代表性图；图2-B为统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图3为本发明实施例2所述SENP1对H9c2细胞迁移的影响迁移小室实验结果图。其中，图3-A为代表性图；图3-B为统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图4为本发明实施例3所述SENP1对erastin诱导H9c2细胞铁死亡的影响结果图。其中，Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图5为本发明实施例3所述SENP1对erastin诱导H9c2细胞脂质ROS聚集的影响结果图。其中，图5-A为代表性流式图；图5-B为统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图6为本发明实施例3所述SENP1对erastin诱导H9c2细胞铁死亡形态的影响结果图。其中，Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图7为本发明实施例3所述SENP1对给予erastin后H9c2细胞铁死亡相关蛋白ACSL4表达的影响结果图。其中，图7-A为免疫印迹图；图7-B为统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞；DMSO为加入DMSO处理的心肌细胞；erastin为加入铁死亡诱导剂erastin处理的心肌细胞。图8为本发明实施例4所述SENP1对H9c2细胞HIF-1表达的影响结果图。其中，图8-A为利用实时定量PCR法进行mRNA水平的表达检测；图8-B为利用免疫印迹法进行蛋白水平的检测；图8-C为蛋白水平表达的统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图9为本发明实施例4所述SENP1对H9c2细胞ACSL4表达的影响结果图。其中，图9-A为利用实时定量PCR法进行mRNA水平的表达检测；图9-B为利用免疫印迹法进行蛋白水平的检测；图9-C为蛋白水平表达的统计图。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图10为本发明实施例4所述SENP1对H9c2细胞VEGF表达的影响结果图。其中，Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。图11为本发明实施例4所述SENP1对HIF-1α和ACSL4的SUMO化修饰结果图。其中，图11-A为利用免疫共沉淀法IP和免疫印迹法验证SENP1和HIF-1α的相互作用关系；图11-B为利用IP和免疫印迹法验证SENP1和ACSL4的相互作用关系；图11-C为利用免疫印迹WesternBlot验证SENP1和HIF-1α及ACSL4蛋白质的相互作用。Ad5F11p.Null代表Ad5F11p.Null感染的心肌细胞；Ad5F11p.SENP1代表Ad5F11p.SENP1感染的心肌细胞。具体实施方式本发明提供了一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。在本发明中，所述的SENP1蛋白为类泛素特异性蛋白酶1。所述SENP1基因用于编码所述SENP1蛋白，具体序列记载于GongL,MillasS,MaulGGandYehET.Differentialregulationofsentrinizedproteinsbyanovelsentrin-specificprotease.J.Biol.Chem.2000，2755：3355-3359。本发明通过研究SENP1蛋白表达对心肌细胞增殖和迁移的影响以及对铁死亡诱导剂erastin诱导的心肌细胞铁死亡的调控作用。本发明通过SENP1调控心肌细胞铁死亡的方法是：利用重组腺病毒Ad5F11p.SENP1感染心肌细胞，观察其对心肌细胞增殖、迁移以及HIF-1α、长链酯酰辅酶A合成酶acyl-CoAsynthetaselong-chainfamilymember4，ACSL4表达的影响，并进一步研究SUMO化修饰在erastin诱导的心肌细胞铁死亡中的作用及机制。结果表明：SENP1蛋白表达能促进心肌细胞增殖和迁移，部分抑制erastin导致的心肌细胞死亡、形态变化和ROS聚集，促进HIF-1α、ACSL4和血管内皮生长因子vascularendothelialgrowthfactor，VEGF的表达；干涉HIF-1α可下调SENP1蛋白的表达。SENP1蛋白抑制erastin诱导的心肌细胞发生铁死亡的过程可能是通过SENP1调控HIF-1α、ACSL4的去SUMO化修饰来实现的。在本发明中，所述SENP1基因不必须是其本身，还可以是含有所述SENP1基因的病毒载体、质粒、重组细胞或组合物。所述SENP1蛋白不必须是其本身，还可以是含有所述SENP1蛋白的重组细胞和或组合物。在本发明中，所述心血管疾病优选包括急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤和心力衰竭中的一种或者多种。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1重组腺病毒-SENP1Ad5F11p.SENP1的制备和纯化将人SENP1基因克隆到穿梭质粒pXCJL1-cmvpA的多克隆位点，获得pXCJL1-cmvpA-SENP1；然后与骨架质粒Ad5F11p通过电转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，于HEK293细胞包装获得重组腺病毒Ad5F11p.SENP1。基因组水平鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。1穿梭质粒pXCJL1-cmv-SENP1的构建首先用PCR方法从人胎盘cDNA文库中扩增SENP1cDNA，将PCR产物克隆至pXCJL1-CMVpA载体的EcoRⅤ和KpnⅠ酶切位点中，从而获得携带人SENP1基因表达盒以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒pXCJL1-CMVpA-SENP1。2重组腺病毒质粒pAd5F11p.SENP1的生成通过电转的方法将鉴定正确的穿梭质粒pXCJL1-CMVpA-SENP1转入携带骨架质粒的BJ5183-Ad5F11p感受态细胞，使其进行同源重组，PacΙ酶切鉴定重组质粒。3重组腺病毒Ad5F11p.SENP1的制备、纯化和滴度测定将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd5F11p.SENP1通过脂质体转染HEK293细胞，使其在细胞内产生重组腺病毒。普通显微镜观察细胞形态改变，9天可见噬斑形成，并逐渐扩大，直至12d出现完全病变。收集细胞和上清，反复冻溶3次后收集上清，获得重组腺病毒Ad5F11p.SENP1。采用Hirt法提取病毒基因组DNA，并经PCR鉴定正确。经大量扩增后，采用氯化铯密度梯度离心纯化，并保存于10％甘油的Hank’s液中备用。紫外分光光度计法波长260nm和有限稀释法MedianTissueCultureInfectiveDose，TCID50分别测定腺病毒Ad5F11p.SENP1的颗粒滴度ViralParticleUnitsperMilliliter，vpml和感染滴度InfectionUnitsperMilliliter，IUml。结果如表1所示。表1重组腺病毒Ad5F11p.SENP1的纯度和滴度测定结果病毒名称颗粒滴度vpml感染滴度IUmlAd5F11p.SENP13.6×10122×1010实施例2SENP1对H9c2细胞生物学特性的影响：1SENP1对H9c2细胞增殖的影响H9c2细胞分别感染Ad5F11p.SENP1与Ad5F11p.Null后继续培养72小时，通过CCK8法检测SENP1对H9c2细胞增殖的影响。结果见图1，图1显示：与对照组相比，培养细胞24h和48h时两组无明显差异，72h时Ad5F11p.SENP1轻度促进H9c2增殖。2SENP1对H9c2细胞迁移的影响划痕实验H9c2细胞分别感染重组腺病毒Ad5F11p.SENP1和对照病毒Ad5F11p.Null24h后，通过划痕实验来观察及测量划痕愈合的长度，计算迁移率。结果见图2-A，图2-A显示：与对照病毒相比，过表达SENP16h和12h时H9c2细胞迁移率轻度增加，提示过表达SENP1可以促进划痕的愈合。将结果进行统计学分析，分析结果见图2-B，说明实验差异具有统计学意义。3SENP1对H9c2细胞迁移的影响迁移小室实验H9c2细胞感染重组腺病毒Ad5F11p.SENP1和对照病毒Ad5F11p.Null24h后，采用迁移小室Transwell法检测过表达SENP1对H9c2细胞迁移能力的影响，结果见图3-A，图3-A显示：与对照病毒相比，过表达SENP1可以促进H9c2细胞迁移。将结果进行统计学分析，分析结果见图3-B，说明实验差异具有统计学意义。实施例3SENP1对erastin诱导的H9c2细胞的影响1SENP1对erastin诱导H9c2细胞铁死亡的影响为了研究SENP1对erastin诱导的心肌细胞铁死亡的影响，我们通过CCK8检测erastin对感染重组腺病毒Ad5F11p.SENP1和对照病毒Ad5F11p.Null后H9c2细胞存活率的影响。结果如图4所示：erastin可以诱导感染了对照病毒Ad5F11p.Null的H9c2细胞死亡；与对照病毒相比，过表达SENP1能明显抑制erastin诱导的心肌细胞死亡；同时给予铁死亡抑制剂Fer-1能抑制erastin诱导的感染了Ad5F11p.Null病毒的H9c2细胞的死亡。上述实验结果进行统计学分析后差异有统计学意义。2SENP1对erastin诱导H9c2细胞脂质ROS聚集的影响为研究过表达SENP1对erastin诱导的脂质ROS的影响，我们通过流式细胞仪检测ROS产物。结果如图5-A所示：erastin可导致感染了对照病毒的H9c2细胞ROS产物增多，峰值右移，而过表达SENP1可抑制脂质ROS的产生，峰值左移。将结果进行统计学分析，分析结果见图5-B，说明实验差异具有统计学意义。3SENP1对erastin诱导H9c2细胞铁死亡形态的影响H9c2过表达SENP1后给予erastin诱导细胞死亡，用姬姆萨染色观察细胞形态学的变化。结果如图6所示：erastin可导致感染了对照病毒Ad5F11p.Null的H9c2细胞形态发生变化，而过表达SENP1可抑制erastin诱导的H9c2细胞形态的改变。4SENP1对给予erastin后H9c2细胞铁死亡相关蛋白ACSL4表达的影响H9c2细胞过表达SENP124h后给予erastin继续培养24h，提取细胞蛋白并行免疫印迹Westernblot检测铁死亡相关蛋白ACSL4表达情况。结果如图7-A所示：erastin可导致对照病毒组ACSL4表达升高；与对照病毒组相比，过表达SENP1可促进ACSL4的表达，给予erastin后ACSL4的表达轻度降低，提示过表达SENP1可能影响铁死亡相关蛋白ACSL4的SUMO化水平。将结果进行统计学分析，分析结果见图7-B，说明实验差异具有统计学意义。实施例4SENP1抑制H9c2细胞铁死亡的可能机制采用免疫沉淀法和蛋白免疫印迹法等检测了SENP1对心肌细胞铁死亡相关因子HIF-1α和ACSL4SUMO化的影响。1过表达SENP1对H9c2细胞HIF-1α表达的影响为研究SENP1对H9c2细胞HIF-1α的调控作用，我们用实时定量PCR法qRT-PCR和免疫印迹法WesternBlot分别检测了过表达SENP1后HIF-1α在RNA水平和蛋白水平的表达情况。结果如图8所示：与对照病毒相比，无论是在RNA水平图8-A还是蛋白水平图8-B，过表达SENP1可促进HIF-1α表达的升高。将结果进行统计学分析，分析结果见图8-C，说明实验差异具有统计学意义差异有统计学意义。2过表达SENP1对H9c2细胞ACSL4表达的影响为研究SENP1对H9c2细胞ACSL4的调控作用，我们用实时定量PCR法qRT-PCR和免疫印迹法WesternBlot分别检测了过表达SENP1后ACSL4在RNA水平和蛋白水平的表达情况。结果如图9所示：与对照病毒相比，无论是在RNA水平图9-A还是蛋白水平图9-B，过表达SENP1可促进ACSL4表达的升高。将结果进行统计学分析，分析结果见图9-C，说明实验差异具有统计学意义差异有统计学意义。3过表达SENP1对H9c2细胞VEGF表达的影响为研究SENP1对H9c2细胞VEGF的调控作用，我们用酶联免疫吸附法ELISA检测了过表达SENP1后VEGF在细胞培养上清中的表达情况。结果如图10所示：与对照病毒相比，过表达SENP1可H9c2细胞分泌VEGF升高，差异有统计学意义。4SENP1对HIF-1α和ACSL4的SUMO化修饰为证明SENP1对HIF-1α和ACSL4具有SUMO修饰作用，首先我们利用生物学信息网分析了HIF-1α和ACSL4的SUMO修饰位点。其次，我们收集了过表达SENP1后H9c2细胞的蛋白并利用免疫沉淀法IP和WesternBlot验证了SENP1和HIF-1α、ACSL4蛋白质的相互作用。结果如图11所示：SENP1可通过调控SUMO化影响HIF-1α、ACSL4蛋白水平。经上述实验证明：SENP1可促进H9c2细胞的增殖和迁移，抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的H9c2细胞死亡、ROS聚集及形态学改变；SENP1可以促进HIF-1α和ACSL4在mRNA和蛋白质水平的表达，并促进VEGF的表达；SENP1对HIF-1α和ACSL4具有SUMO修饰作用，SENP1可能通过SUMO修饰作用调节H9c2细胞铁死亡。因此，SENP1是一种新的调控心肌细胞铁死亡的物质。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种SENP1基因和或SENP1蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。2.包括权利要求1所述SENP1基因的病毒载体、质粒、重组细胞或组合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。3.包括权利要求1所述SENP1蛋白的重组细胞和或组合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述心血管疾病包括急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤和心力衰竭中的一种或者多种。

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