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申请/专利权人：山东农业大学

摘要：本发明提供了一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒、构建方法、表达及其应用，属于基因工程技术领域，以禽波氏杆菌DNA及以鸡脾脏mRNA为模版合成的cDNA为模版，通过PCR分别获得ompA‑linker基因和鸡IgY‑Fc‑linker基因，再将两份PCR产物进行SOE‑PCR得到ompA‑linker‑Fc融合基因，将融合基因连接至PMD18‑T克隆质粒，连接转化后对重组质粒进行测序，双酶切并连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转化子，获得pPIC9‑ompA‑Fc融合质粒。本发明成功克隆禽波氏杆菌ompA及鸡IgYFc，并将两种基因成功融合至表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，成本低廉，增强了融合蛋白的活性。

主权项：1.一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒，其特征在于，根据NCBI中查找如SEQIDNO：1所示的禽波氏杆菌标准株ompA和如SEQIDNO：2所示的鸡IgYFc核苷酸序列，设计两对特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点和linker连接子；通过PCR方式分别扩增出两个基因ompA-linker和IgYFc-linker，并通过SOE-PCR方法将两个基因融合成如SEQIDNO：3所示的ompA-Fc基因片段；以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9表达质粒为载体，在pPIC9的限制性酶切位点NotI和XholI之间插入ompA-Fc基因全长，构建成一种含ompA-Fc基因全长和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9重组质粒，即pPIC9-ompA-Fc重组质粒；其中，所述禽波氏杆菌ompA基因序列和所述鸡IgY-Fc基因序列分别加入的linker连接子为柔性linker肽段连接子，所述连接子为10个氨基酸，所述连接子具有氨基酸序列自选的为：GGGGSGGGGS；其中，所述pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，包括以下步骤：1从NCBI中查找如SEQIDNO：1所示的禽波氏杆菌标准株ompA和如SEQIDNO：2所示的鸡IgYFc核苷酸序列，与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定引物设计中引入pPIC9质粒上携带的酶切位点为XhoI和NotI；2）pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建：①禽波氏杆菌ompA-linker的PCR扩增：以禽波氏杆菌P5株DNA为模板，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到ompA-linker；鸡IgYFc-linker的PCR扩增：提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到鸡IgYFc-linker；分别胶回收ompA-linker和Fc-linker基因，以如SEQIDNO：4所示的禽波氏杆菌ompA上游引物Primer1和如SEQIDNO：7所示的鸡IgYFc下游引物Primer4特异性引物进行SOE-PCR扩增得到如SEQIDNO：3所示的ompA-Fc融合基因；②将胶回收得到的融合基因ompA-Fc，经过16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒；③将双酶切PMD18-T-ompA-Fc重组质粒得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化，酶切及测序得到正确的重组表达质粒，并命名为：pPIC9-ompA-Fc；所述两对特异性引物具体为：禽波氏杆菌ompA上游引物SEQIDNO：4；禽波氏杆菌ompA下游引物SEQIDNO：5；鸡IgYFc上游引物SEQIDNO：6；鸡IgYFc下游引物SEQIDNO：7。

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百度查询： 山东农业大学 一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母表达系统中的诱导表达及其应用