申请/专利权人：浙江海洋学院

申请日：2016-01-13

公开（公告）日：2020-08-11

公开（公告）号：CN105420330B

主分类号：C12P21/06(20060101)

分类号：C12P21/06(20060101);C07K7/06(20060101);C07K1/36(20060101);C07K1/34(20060101);C07K1/20(20060101);C07K1/18(20060101);C07K1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.08.11#授权;2016.04.20#实质审查的生效;2016.03.23#公开

摘要：本发明公开了一种孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，本发明以孔鳐软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly‑Glu‑Glu‑Gly‑Pro‑Arg‑GlyGEEGPRG，ESI‑MS测定分子量为700.71Da；制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。

主权项：1.孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，所述抗氧化肽为Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly，所述抗氧化肽的制备方法包括以下步骤：1）孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备：称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4～6倍体积的1.0molL盐酸胍溶液中，于4℃下搅拌抽提36～48h；提取液在4℃下以4000～6000rmin离心15～25min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4℃、10000～12000rmin离心15～25min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8000的透析袋中，用pH值为7.6Tris-HCl的缓冲液于4℃下透析24～48h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物；2）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取孔鳐软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20℃下静置4～6h后，于4℃、10000～12000rmin高速离心20min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；3）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5mL溶于Tris-HCl缓冲液，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入胰蛋白酶，于40℃酶解3～5h，然后于90℃、10min灭酶活，酶解液于4℃、10000～12000rmin离心15～25min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；4）孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽；其中，所述步骤1）中的盐酸胍溶液含0.02molLMES、0.02molLEDTA，pH值为7～8；步骤3）中的Tris-HCl缓冲液为0.05molL，pH值为7.5～8.5；胰蛋白酶为1.9×104Ug；步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mgmL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1molL、0.5molL和1.0molLNaCl溶液进行洗脱，流速为0.6～0.8mLmin，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mgmL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8mLmin，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μgmL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，收集DPPH自由基和羟自由基清除活性最高的抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly，ESI-MS测定分子量为700.71Da。

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