申请/专利权人：杭州师范大学

申请日：2018-02-06

公开（公告）日：2020-10-09

公开（公告）号：CN108441438B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A01N63/20(20200101);A01P21/00(20060101);C12R1/41(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.09#授权;2018.09.18#实质审查的生效;2018.08.24#公开

摘要：本发明公开了一种根瘤菌WYJ‑E13及其在制备温郁金生长促进剂中的应用，在接入WYJ‑13菌液的培养基上，温郁金组培苗能生长的更快、分枝更多、根系更多，即WYJ‑13具有促进温郁金组培苗生长的功效。

主权项：1.根瘤菌（Rhizobiumsp.）WYJ-E13，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年10月16日，保藏编号CGMCCNo.14808，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

全文数据：根瘤菌WYJ-E13及其在制备温郁金生长促进剂中的应用一技术领域[0001]本发明涉及一种利用与植物共生的有益微生物作为植物生长促进菌及其应用方法D二背景技术[0002]温郁金是一种具有广泛应用价值的植物资源。它花形美观，作为观赏植物供盆栽或绿化;而且还具有预防和治疗多种肿瘤的功效。其主要活性成分为挥发油和姜黄素;姜黄素作为一2天然安全的食品色素，被广泛应用于食品添加剂。特别是近年来的研究表明，温郁金中分离的药用成分榄香烯，具有抗肿瘤的特效。温郁金主要以根茎繁殖，但易感染病毒，且受到多种病虫害的危害。另一方面，植物体内均存在多种内生菌，内生菌的次生代谢物与宿主植物形成互惠的关系，它直接影响宿主的生长发育，而且在病虫害的生物防治和医药工业上具有许多重要的用途，越来越受人们的关注与重视。目前，国内外有多篇关于植物生长促进菌PGPB应用的研宄报告，如从印度塔尔沙漠中植物根部发现、被广泛应用不同种类植物的印度梨形孢Piriformosporaindica，它可促进植物对营养吸收，进而促进生长发育。[0003]综上所述，利用从植物中分离的有益内生菌作为植物生长促进菌PGPB，在生产上具有广泛的应用价值。为此，本发明利用根切块分离法，从温郁金块根中分离的内生菌中筛选获取了一种内生菌，对其进行形态和分子水平的分类鉴定，属于根瘤菌属，命名为WYL-E13。进一步的研宄分析表明，该内生菌具有促进温郁金生长的功能。三发明内容[0004]本发明目的是提供一种根瘤菌属内生菌WYJ-E13,该内生菌具有促进温郁金生长的功能，可用于温郁金的生产实践中，促进温郁金的生长发育，提高温郁金的产量。[0005]本发明采用的技术方案是：[0006]本发明提供一株新的内生菌菌株一根瘤菌Rhizobiumsp.WYJ-E13,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年10月16日，保藏编号CGMCCNo.14808,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。[0007]本发明还提供一种所述根瘤菌WYJ-E13在制备温郁金生长促进剂中的应用，所述的应用是在温郁金组织培养过程中，在温郁金组培苗基部注入根瘤菌WYJ-E13菌液实现的，所述温郁金生长促进剂为根瘤菌WYJ-E13经发酵培养后的菌体细胞重悬后获得的根瘤菌ffYJ_E13菌液。[0008]进一步，所述根瘤菌WYJ-E13菌液0D_值为0•01-0•05。[0009]进一步，所述根瘤菌WYJ-E13菌液按如下方法制备:将根瘤菌WYJ-E13接种在含终浓度50mgLStr链霉素）的PDA液体培养基中，28。0、15〇-2〇〇1'111丨11震荡培养1211，离心，取沉淀菌体，用新鲜的MS培养基稀释菌体至㈤6QQ值为0.〇1-〇.05。[0010]更进一步，所述应用的方法为:将高度2-3cm温郁金组培苗接入MS+6_BA6-苄氨基腺嘌呤2mgL+IAA吲哚-3-乙酸）lmgL固体培养基，在组培苗基部加入根瘤菌WYJ-E13菌液，22±2°C，20001ux光照12hd的培养条件下培养，促进温郁金生长。本发明所述温郁金组培苗即为温郁金块根外植体消毒后，接种在MS+6-BA2mgL+ZTlmgL+IAAlmgL+Cef头孢霉素）500mgL的丛生芽培养基中，在20-25°C，光照1000〜12001ux，12小时光照天下培养获得的丛生芽。[0011]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:在接入WYJ-13菌液的培养基上，温郁金组培苗能生长的更快、分枝更多、根系更多，即WYJ-13具有促进温郁金组培苗生长的功效。四）附图说明[0012]图1WYJ-E13菌落。[0013]图2WYJ-E13在激光共聚焦显微镜下观察的大小。[00M]图3温郁金组培苗接种内生菌和未接种内生菌生长情况对比。a:接种内生菌WYJ-13;B:未接种内生菌。“―”所示接种的内生菌长出的菌斑。五具体实施方式[0015]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0016]PDA液体培养基组成为：除皮马铃薯200g切成小块，加水lOOOmL煮烂，用两层纱布过滤获取滤液，再加葡萄糖20gL，琼脂15-20gL，自然pH值。[0017]MS基本培养基终浓度组成为:NH4NO31.65gL、KN〇31.9gL、CaCl2*2H200.44gL、MgS04.7H200.37gL、KH2P〇40_17gL、KI0.83mgL、H3B035.2mgL、MgS〇4.7H2022.3mgL、ZnS〇4.7H203_6mgL、Na2Mo04.2H2〇0.25mgL、CuS〇4-5H200_025mgL、C0CI2•6H2O0.025mgL、Na2EDTA37_3mgL、FeS〇4•7H2〇27.8mgL、肌醇100mgL、甘氨酸2mgL、盐酸硫胺素〇.lmgL、盐酸吡哆醇〇•5mgL、烟酸0.5mgL、蔗糖30gL、琼脂粉10gL，溶剂为水，pH为5.6〜6.0。[0018]实施例i[0019]—、材料和方法[0020]i、实验材料:温郁金，栽培品种温郁金1号，由浙江温州市天禾生物科技有限公司惠赠。温郁金种植于杭州师范大学生命与环境科学学院玻璃房中。[0021]2、块根的消毒和内生菌的分离[0022]生长5个月的实生苗（实生苗参见专利申请2017108783535实施例1，取直径约1-2cm椭圆形块根，用自来水冲洗干净，放入75%酒精中浸泡化“后，再用〇•1%升汞消毒15min，最后用无菌水冲洗3次。将块根切割成3-5圓的小块，置于含或者不含Str50mgL3铃薯葡甸糖琼脂PDAi昔养基上，切面朝向培养基，每皿放置4块。将上述同样处理过的块根未经切割直接滚印于对照皿，用于检测材料表面灭菌效果，同时在超净台中放置丨个敞开盖子的平皿以检测操作环境的洁净度。实验组与对照组均于281：恒温避光培养3—5天。待有菌斑从温郁金块根切面长出时，用接种环划线接种到新的含或者不含Str50mgL的PDA培养基上继续繁殖培养，重复几次至获得分离纯化的菌株。[0023]3、菌株WYJ-E13基因组DNA的提取和分类的分子鉴定[0024]利用生工生物工程（上海）有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株WYJ-E13的DNA，具体操作参考试剂盒操作说明。[0025]使用通用菌种鉴定引物27f5,-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’），1492r5,-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’），进行PCR扩增。PCR扩增条件是，35yL反应体积中含有DNA模板（100ngL2iiL，dNTPlmmolL2uL，TaqDNApolymerase2UliLlyL，10XBuffer3.5yL，ITS1lOOpmolL和ITS2lOOpmolL各2uL，ddH2022•5yL。1•5%琼脂糖凝胶电泳，用生工生物工程上海有限公司PCR产物回收试剂盒回收纯化扩增出的PCR条带。纯化的PCR产物连接到PMD18-T克隆载体，连接产物转入DH5a感受态细胞。筛选阳性克隆送交生工生物工程上海股份有限公司测序。利用Blast软件http:www•ncbi•nlm•nih•govblast对所得序列进行在线核苷酸比对分析，确定菌株WYJ-E13的种属。[0026]4、无菌苗在接种根瘤菌WYJ-E13的培养基上培养[0027]根瘤菌WYJ-E13在含终浓度Str50mgL的PDA液体培养基100mL中，28°C，150-200rmin震荡培养12h，菌液离心后，除去上层培养基获得沉淀菌体，用新鲜的MS培养基稀释菌体至0D600值约为0•02，获得稀释后的菌液。在200mL培养瓶中，加入MS+6-BA2mgL+IAAlmgL固体培养基50mL，冷凝后，接入高度在2-3cm的温郁金组培苗组培苗参见专利申请2017108783535实施例1丛生芽）；同时，在组培苗基部用加样枪加入10此的稀释后的菌液。同样，作为对照，在200mL培养瓶中，加入MS+6-BA2mgL+IAAlmgL固体培养基50mL，冷凝后，接入高度在2-3cm的温郁金组培苗；同时，在组培苗基部用加样枪加入10此MS培养基作为对照。处理组及对照组均重复3次。22±2°C，20001ux光照12hd的培养条件下培养1个月后进行比较观察。[0028]二、结果和讨论[0029]1、菌株WYJ-E13的分离获得和分子分类鉴定[0030]通过试验，在获得的16个菌株中，有一株命名为菌株WYJ-E13C图1和图2。通过设计特征引物、扩增出16SrDNA特征序列SEQIDN0.1，序列大小为1445bp。具体序列如下，其中上游和下游引物序列均被测出：[0031]AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACACGTGGGAACGTACCCTTTACTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTTTGGGGAAAGATTTATCGGTAAGGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTGTCTTGAGTATGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGCCCGGCTACTTGCAGAGATGCAAGGTTCCCTTCGGGGACCGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTGGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA[OO32]根据测序结果，进行Blast分析，Blast比对显示，WYJ-El3菌株属于根瘤菌属Rhizobium，是前人未曾报道、为一个新型内生根瘤菌Rhizobiumsp.，命名为根瘤菌Rhizobiumsp.WYJ-E13,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2〇17年10月I6日，保藏编号CGMCCNo.14808,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。[0033]2、温郁金组培苗直接接种WYJ-E13对温郁金生长的影响[0034]温郁金组培苗接种内生根瘤菌WYJ-E13和未接种内生根瘤菌WYJ-E13生长情况对比结果显示，接种内生根瘤菌WYJ-E13的组培苗生长明显优于对照组，能明显促进温郁金组培苗根部和植株的生长图3。[0035]利用从植物中分离的有益内生菌作为植物生长促进菌pGpB，在生产上具有广泛的应用价值。为此，本发明获得的内生菌WYJ-E13在温郁金的栽培生产上具有重要的应用价值，可以提高温郁金的种植效益，有利于促进“浙八味”温郁金的可持续性发展。

权利要求：1.根瘤菌Rhizobiumsp.WYJ-E13,保藏于中国微生物囷种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2〇17年10月16日，保藏编号CGMCCNo.14808，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。2.—种权利要求1所述根瘤菌WYJ-E13在制备温郁金生长促进剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述温郁金生长促进剂为根瘤菌WYJ-E13经发酵培养后的菌体细胞重悬后获得的根瘤菌WYJ-E13菌液。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述根瘤菌WYJ-E13菌液OD600值为0•01-0•05。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述根瘤菌WYJ-E13菌液按如下方法制备:将根瘤菌WYJ-E13接种在含终浓度50mgL链霉素的PDA液体培养基中，28°C、150-200rmin震荡培养12h，离心，取沉淀菌体，用新鲜的MS培养基稀释菌体至㈤6QQ值为0•01-0•〇5。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将高度2-3Cm温郁金组培苗接入MS+6_BA2mgL+IAAlmgL固体培养基，在组培苗基部加入根瘤菌WYJ-E13菌液，22±2°C、20001ux光照12hd的条件下培养，促进温郁金生长。

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