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申请/专利权人：安徽医科大学第一附属医院;深圳华大基因研究院

摘要：本发明涉及分子遗传学和皮肤病学领域，具体涉及银屑病罕见InDels及其对银屑病发生的风险预测方法。所述InDels包括：LEKR1基因的chr3_158211991_IATGATAACTGGAAGGAGAAGGATGATAACTGGAAGGAG，剪切位点InDel；AFF3基因的chr2_99541763_IAGT，剪切位点InDel；ABCG2基因的chr4_89258443_DAAAAGTG，剪切位点InDel；GIPR基因的chr19_50869251_DCCTGCTCATCTTGAGTTTGTTCAGGTGGGA，剪切位点InDel；ANXA7基因的chr10_74828010_DCT，移码突变InDel；SYTL2基因的chr11_85114805_IC，移码突变InDel；FYCO1基因的chr3_45983483_DCT，移码突变InDel。本发明可以高效地对跟银屑病相关的基因进行测序并结合高性能计算资源进行快速分析，进而得到变异检测结果，对InDels的检测准确率高于现有其他技术。

主权项：1.一种检测生物标记物的试剂在制备银屑病检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标记物为选自下述一种或两种以上InDels：LEKR1基因的chr3_158211991_IATGATAACTGGAAGGAGAAGGATGATAACTGGAAGGAG，剪切位点InDel；AFF3基因的chr2_99541763_IAGT，剪切位点InDel；ABCG2基因的chr4_89258443_DAAAAGTG，剪切位点InDel；GIPR基因的chr19_50869251_DCCTGCTCATCTTGAGTTTGTTCAGGTGGGA，剪切位点InDel；ANXA7基因的chr10_74828010_DCT，移码突变InDel；SYTL2基因的chr11_85114805_IC，移码突变InDel；FYCO1基因的chr3_45983483_DCT，移码突变InDel。

全文数据：银屑病罕见InDeIs及其对银屑病发生的风险预测方法技术领域[0001]本发明涉及分子遗传学和皮肤病学领域，具体涉及银屑病罕见InDels及其对银肩病发生的风险预测方法。背景技术[0002]银屑病是一种慢性的自身免疫复杂疾病，主要临床特征是病变皮肤有红斑，鳞屑以及瘙痒，局部和全身皮肤都可能发生病变。[0003]目前针对银肩病已经进行了很多相关的研宄，但是还没有明确其病因，一般认为与该病相关的因素包括遗传、生活习惯、免疫、感染、内分泌因素等。[0004]与本申请比较接近的现有技术方案:利用snparray对目标样本的已知基因区域进行基因分型，将得到的snp分型信息进行差异分析。[0005]由于现有技术有较多的局限性，如只能对已知位点进行检测，只能基于snp进行分型，无法对超大样本量在短时间内进行变异检测，对InDels的检测准确性不高，检测成本较高等，基于能检测到更多相关基因的位点以及不同的生物标记物，由于InDels检测本身具有较大的难度，目前暂没有较为准确可行的方法对InDels进行检测，因此我们针对InDels的检测建立了较为准确可靠的方法，而后续的实验验证也证明了我们的方法是准确可靠的。发明内容[0006]本发明的目的是解决上述现有技术的不足，在银屑病患者的基因组中检测罕见的插入或者删除（InDels，InsertionsandDeletions变异，提供一种银屑病罕见InDels及其对银屑病发生的风险预测方法。[0007]本发明是通过以下技术方案实现的：[0008]银肩病罕见InDels，所述InDels包括：[0009]LEKR1基因的chr3_158211991_IATGATAACTGGAAGGAGAAGGATGATAACTGGAAGGAG，剪切位点InDel;[0010]AFF3基因的chr2_99541763_IAGT，剪切位点InDel;[0011]ABCG2基因的chr4_89258443_DAAAAGTG，剪切位点InDel;[0012]GIPR基因的chrl9_50869251_DCCTGCTCATCTTGAGTTTGTTCAGGTGGGA，剪切位点InDel；[0013]ANXA7基因的chrl0_74828010_DCT，移码突变InDel;[0014]SYTL2基因的chrl1_85114805_IC，移码突变InDel;[0015]FYC01基因的chr3_45983483_DCT，移码突变InDel。[0016]利用所述的银肩病罕见InDels对银屑病发生的风险预测方法，所述预测通过以下步骤实现：[0017]1收集可能的银肩病患者的外周血；[0018]2提取外周血中的DNA;[0019]⑶对目标DNA进行建库；[0020]⑷使用已设计好的探针进行捕获得到目标区域的片段；[0021]对捕获得到的目标区域片段进行高通量测序；[0022]⑹将得到的下机数据进行信息分析；[0023]⑺检测是否存在上述移码突变或者剪切位点的InDels。[0024]本发明的有益效果在于：[0025]1由于是自主设计和研发的目标区域捕获探针，可以高效地对跟银屑病相关的基因进行测序并结合高性能计算资源进行快速分析，进而得到变异检测结果。这样不仅可以对大样本量进行检测，同时也降低了操作时间和检测成本；[0026]2就目前的验证结果看，本发明对InDels的检测准确率高于现有其他技术。具体实施方式[0027]为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。[0028]实施例1银肩病罕见InDels的获得[0029]针对近几年收集的9964个散发银屑病患者和9969例正常人的外周血样本，发明人对相关文献进行检索和查阅，尽可能收集与银屑病相关的基因，此外，不仅仅局限于在银屑病研宄中的报道，在跟免疫疾病相关的研究结果也会纳入基因收集范畴，并针对这些基因进行探针设计，而后定制了目标区域捕获芯片，结合HiSeq2000高通量测序仪对9964例病例进行目标区域捕获测序，得到90个碱基长度的读长对测序序列，每个样品的平均测序深度为64X。[0030]使用BWA比对软件将得到的测序序列比对到人类基因组参考序列版本36.3，比对结果以BAM文件的格式保存，然后使用变异检测软件SOAPPopIndel对BAM文件进行处理，进而得到可信度比较高的候选变InDels。对于这些候选的InDels，首先是把在银肩病患者存在而在正常人不存在的位点提取出来，之后再采用千人III期数据库、国际HapMap数据库、dbsnpl38数据库，外显子数据库和ExAC数据库对变异结果进行注释。为了有效地调查银肩病的候选InDels变异，只提取在上述数据库没有报道的InDels。最后，提取属于移码突变或者剪切位点的InDels作为最后的罕见InDels变异结果。[0031]由于目标区域测序存在一定程度的假阳性，我们利用Sanger测序方法，对最后的罕见InDels变异结果进行验证，7个基因对应的7个移码突变或者剪切位点的InDels都被验证出来了：[0032]LEKR1基因的chr3—158211991—IATGATAACTGGAAGGAGAAGGATGATMCTGGMGGAG，剪切位点InDel;[0033]AFF3基因的chr2_"54l763_IAGT，剪切位点InDel;[0034]ABCG2基因的chr4_89258443_DAAAAGTG，剪切位点InDel;[0035]GIPR基因的chr19—50869251—DCCTGCTCATCTTGAGTTTGTTCAGGTGGGA，剪切位点InDel；[0036]ANXA7基因的chrl0_74828010_DCT，移码突变InDel;[0037]SYTL2基因的chrl1_85114805_IC，移码突变InDel;[0038]FYC01基因的chr3_45983483—DCT，移码突变InDel;[0039]鉴于这些InDels变异只在银屑病患者中存在而不在正常人存在，并且在多个大型人类数据库中均没有被报道，对于这些患者从遗传角度来找寻银肩病的风险因素，更加具有针对性。[0040]实施例2利用银屑病罕见InDels对银肩病发生的风险进行预测[0041]1收集可能的银屑病患者的外周血；[0042]2用盐析方法提取外周血中的DNA;[0043]⑶根据制造商的说明从3微克的基因组DNA进行文库构建，基因组DNA使用Tris-EDTAbuffer进行稀释，并打断成500bp左右的片段，使用T4polynucleotide酶，T4DNApolymerase和Klenowpolymerase对片段末端进行补平，然后在片段尾部加上A碱基。使用T4DNAligase，让带有T碱基的illuminate测序接头可以绑定在有A碱基尾部的片段，最后，被接上接头的片段通过PCR进行扩增。[0044]4根据制造商的使用说明书RocheNimbleGen，对于每个样本的文库，使用已设计好的探针在65°C的条件下进行70小时的片段杂交捕获，然后在47°C和室温的条件下对捕获的片段进行洗漆，之后使用PlatinumPfxDNApolymeraseInvitrogen在以下操作进行捕获片段的扩增:在94°C下孵化2分钟，然后分别在94孵化15秒，58°C孵化30秒，72°C孵化50秒以及最后一个延长步骤72°C孵化5分钟进行15个循环的PCR扩增；[0045]5对纯化之后的PCR产物在IlluminaHiSeq2000测序仪上进行标准的2X90-bp双末端读长测序；[0046]6将得到的下机测序数据进行信息分析:使用BWA比对软件将得到的测序序列比对到人类基因组参考序列版本36.3，比对结果以BAM文件的格式保存，然后使用变异检测软件SOAPPopIndel对BAM文件进行处理，进而得到可信度比较高的候选变InDels。对于这些候选的InDels，首先是把在银肩病患者存在而在正常人不存在的位点提取出来，之后再采用千人III期数据库、国际HapMap数据库、dbsnpl38数据库，外显子数据库和ExAC数据库对变异结果进行注释。为了有效地调查银肩病的候选InDels变异，只提取在上述数据库没有报道的InDels。最后，提取属于移码突变或者剪切位点的InDels作为最后的罕见InDels变异结果；[0047]⑺根据检测结果判断是否存在上述移码突变或者剪切位点的InDels。[0048]对比例[0049]EAConsortium，MLek等.Analysisofprotein-codinggeneticvariationin60,706humans.Nature,2016,5367616:285.[0050]实施例和对比例的比较：[0051]对比例收集了60706个正常人的全外显子数据，实施例收集了9964个散发银肩病患者和9969例正常人的样本。对比例的60606个样本是进行了全外显子测序，而实施例是对感兴趣的区域进行了目标区域捕获测序。对比例使用的是GATKGenomeAna1ysisToolkit进行变异检测，而实施例使用的是自主开发的SOAPPopIndel进行变异检测。对比例的InDels的假阳性率达到了2.17%，而实施例7个InDels在对应的31个样本中全部验证出来了。（说明：由于全外显子是捕获人类基因组上所有的外显子进行测序，而我们的实施例只是捕获我们比较感兴趣的区域，所以数据量不一样）由此可见，本发明方法可大大降低工作量，减少了操作时间和检测成本，同时还提高了检测准确率。[0052]以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

权利要求：1.银屑病罕见InDels，其特征在于，所述InDels包括：LEKR1基因的chr3_158211991_IATGATAACTGGAAGGAGAAGGATGATMCTGGAAGGAG，剪切位点InDel;AFF3基因的chr2_99541763_IAGT，剪切位点InDel;ABCG2基因的chr4_89258443_DMAAGTG，剪切位点InDel;GIPR基因的chrl9_5〇869251_DCCTGCTCATCTTGAGTTTGTTCAGGTGGGA，剪切位点InDel;ANXA7基因的chrl0_74828010_DCT，移码突变InDel;SYTL2基因的chrll_85114805_IC，移码突变InDel;FYC01基因的chr3_45983483_DCT，移码突变InDel。2.利用权利要求1所述的银屑病罕见InDels对银肩病发生的风险预测方法，其特征在于，所述预测通过以下步骤实现：1收集可能的银肩病患者的外周血；2提取外周血中的DNA;3对目标DNA进行建库；4使用己设计好的探针进行捕获得到目标区域的片段；5对捕获得到的目标区域片段进行高通量测序；6将得到的下机数据进行信息分析；7检测是否存在上述移码突变或者剪切位点的1nDels。

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