申请/专利权人：江苏大学

申请日：2018-05-11

公开（公告）日：2021-05-25

公开（公告）号：CN108896750B

主分类号：G01N33/53(20060101)

分类号：G01N33/53(20060101);G01N21/64(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.05.25#授权;2018.12.21#实质审查的生效;2018.12.21#实质审查的生效 ;2018.11.27#公开

摘要：本发明属于分析化学领域，提供了一种BSA‑AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法和用途。该发明包括1制备BSA‑AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器；2尿酸酶催化尿酸生成H2O2；3用BSA‑AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器检测H2O2，从而检测尿酸含量。与现有技术相比，BSA‑AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器不仅具有荧光传感器时间短，操作简单，无需处理前期样品，无毒性，成本低等优点，还较于单荧光传感器有更高的灵敏度和准确度。血清中尿酸水平与人体疾病息息相关，发明一种比例型荧光传感器检测尿酸具有重要的意义。

主权项：1.一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1制备牛血清蛋白--金银合金纳米簇BSA-AuAgNCs水溶液，备用；将4mL的氯金酸溶液和1mL的硝酸银溶液混合，加入到5mL的牛血清蛋白溶液中，强有力搅拌混合5分钟后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，然后置于37℃的恒温油浴锅反应12小时，反应结束后用超纯水透析纯化48小时，得到牛血清蛋白--金银合金纳米簇水溶液；氯金酸溶液的浓度为10mM，硝酸银溶液的浓度为10mM，牛血清蛋白溶液的浓度为0.75mM，金银的摩尔比为4:1；2建立BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器：将步骤1得到的BSA-AuAgNCs水溶液、OPD、HRP加入到稀释液磷酸盐缓冲液中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器；其中，所述BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，OPD的浓度为50～300μM；HRP的浓度为10ngmL。

全文数据：一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法和用途技术领域[0001]本发明属于分析化学领域，涉及一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法和用途。背景技术[0002]尿酸2,6,8-三羟基嘌呤是人体核蛋白和核酸中嘌呤分解代谢的最终产物。当机体出现代谢紊乱时，会引起嘌呤过量，嘌呤代谢产生的尿酸也相应增加。一般来说，尿酸水平过高会引起人类的相关疾病，例如痛风，肾脏疾病和心血管疾病等。因此，在临床诊断领域中分析尿酸来早期诊断嘌呤代谢疾病是非常必要的。[0003]迄今为止，人血清中尿酸的检测工具很多，如酶法，尿酸传感器，电化学法，髙性能液相色谱等。与以前报道的检测尿酸的方法相比，基于金属纳米材料的荧光传感器具有检测时间短，操作简单，无需处理以往样品，无毒性，成本低等优点。然而，这种基于金属纳米材料检测策略常采用单荧光测试，易受样品的环境条件和光检测器的漂移等因素的影响，这限制了检测的灵敏度和准确度。幸运的是，因为比例型荧光传感器允许在两个不同的波长下同时测量荧光强度，可以有效避免背景荧光的潜在干扰，所以它的检测灵敏度更高和准确性更强。目前，使用比例型荧光检测方案的报道已经有很多。因此，比例型荧光传感器策略的发展具有重要的意义，而且通过比例型荧光传感器对血清中尿酸的检测并无报道。发明内容：[0004]本发明的目的是建立一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器，并用于检测血清中的尿酸。[0005]一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：[0006]1制备牛血清蛋白一金银合金纳米簇BSA-AuAgNCs水溶液：[0007]将4mL的氯金酸（10mM和lmL的硝酸银（10mM混合金银摩尔比为4:1，加入到5mL的牛血清蛋白溶液〇•75mM中，强有力搅拌混合5分钟后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，然后置于37°C的恒温油浴锅反应12小时，反应结束后用超纯水透析纯化48小时，得到牛血清蛋白一金银合金纳米簇水溶液；[0008]牛血清蛋白为保护剂和还原剂。[0009]2建立BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器：[0010]将步骤（1得到的BSA-AuAgNCs水溶液、0PD、HRP加入到稀释液磷酸盐缓冲液中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。[0011]步骤2中，所述BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，OPD的浓度为50〜300uM;HRP的浓度为10ngmL;所用磷酸盐缓冲液浓度为10mM,pH=6.0〇[0012]HRP为催化oro的酶。[0013]将本发明制备的BSA-AUAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器用于检测尿酸的用途，具体检测方法，包括如下步骤：[0014]1尿酸酶催化尿酸生成H2〇2;[0015]催化pH为4〜8;催化时间为10〜60分钟;催化温度为25〜5TC;尿酸酶含量为5〜200jigmL〇[0016]将步骤（1制得的H2〇2加入BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，反应温度为25〜50°C;时间为10〜60分钟;检测其荧光强度，580nm处荧光强度为l58〇,690nm处荧光强度为I69Q，得出I58QI690;[0017]3配置一系列不同浓度的尿酸，经尿酸酶催化后，加入BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，反应完全后检测产物荧光，根据不同浓度的尿酸对应的荧光信号强度得到一系列的158Q1690，建立标准曲线。[0018]本发明的有益效果为：[0019]1本发明基于无色、无荧光的0PD在HRP的催化下，被H2〇2氧化为黄色有荧光的oxOPD荧光峰值I58Q，同时，H2〇2可降低BSA-AuAgNCs荧光峰值（I69Q，荧光比值l58〇l69〇与H2O2的浓度成正比例。而尿酸酶催化尿酸产生H2〇2,因此可利用上述BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器对尿酸进行检测。[0020]2本发明所构建的比例型荧光传感器检测方法特异性好、灵敏度高、检测限低，可有效避免背景荧光的潜在干扰，为人体血清中的尿酸检测提供了一条有效的新途径。附图说明[0021]图1为在不同尿酸浓度0-90iiM作用下比例型荧光传感器的荧光光谱图。[0022]图2为比例型荧光传感器的荧光比率值I580I690与尿酸浓度0-90yM的关系图，插图为5-50yM的尿酸与荧光比率值158〇169的线性关系图。[0023]图3为不同干扰物质对比例型荧光传感器的荧光比率值I58QI69Q的影响图。[0024]图4为使用本发明制备的荧光传感器左和使用AU2700全自动生化分析仪右分别分析血清中尿酸的结果。[0025]图5不同oro浓度对BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的影响。具体实施方式[0026]下面用实例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实例中未标明具体条件的实验中，均按照常规条件，或制造厂商建议条件。[0027]实例1[0028]1制备牛血清蛋白一金银合金纳米簇BSA-AuAgNCs水溶液：[0029]将4mL的氯金酸（10mM和lmL的硝酸银（10mM混合使金银摩尔比为4:1;氯金酸和硝酸银的总体积保持5mL，加入到5mL的牛血清蛋白水溶液0•75mM中，强有力搅拌混合5分钟后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，然后置于37°C的恒温油浴锅反应12小时，反应结束后用超纯水透析纯化48小时，得到牛血清蛋白一金银合金纳米簇水溶液；[0030]2建立BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器：[0031]将步骤⑴得到的BSA-AuAgNCs水溶液、0PD、HRP加入到磷酸盐缓冲液（10mM，pH=6.0中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。其中，BSA-AuAgNCs的浓度为2〇nM，0PD的浓度为1OOyM;HRP的浓度为1〇ngmL。[0032]尿酸酶50ugtnL与不同浓度的尿酸O-lOOuM在37°C的黑暗环境中温育45分钟产生出〇2。然后将上述反应中所产生的75uLH2O2注入BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器，在温度为37°C的条件下，反应45分钟，测定荧光强度值I69Q和158〇,并在450-850mn的发射波长范围内收集的荧光光谱。[0033]⑶特异性分析：[0034]由于本发明旨在开发检测血清样本中尿酸的含量，我们测定了一些常见的潜在干扰物质，包括相关金属离子K+，Na+，糖苷葡萄糖），氨基酸L-苯丙氨酸，L-酪氨酸等。我们选择上述物质的浓度为5.OmM，而尿酸的浓度为0.2mM。如图3所示，与其他物种相比，即使尿酸含量低于其他物质25倍，依然只有尿酸的I58QI69〇明显上升，这强烈地表明，BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器具有很强的抗干扰能力和检测尿酸的高度特异性。[0035]⑷血清中尿酸的检测：[0036]收集人血清样品，用磷酸缓冲液稀释10倍，无需其他预处理。尿酸酶50iigmL与不同的血清样本分别混合，在37°C的黑暗环境中温育45分钟以产生H2〇2。然后将上述反应中所产生的75yLH202注入BSA-BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器，在温度为37°C的条件下，反应45分钟，测定荧光强度值I69Q和I58Q，并在450-850nm的发射波长范围内收集的荧光光谱。[0037]如图1所示，随着尿酸浓度的增加，580nm处的荧光强度在逐渐增强，690nm处的荧光强度在逐渐降低。[0038]从图2得出了，比例型荧光传感器的荧光比率值（158〇169与尿酸浓度的关系图，随着尿酸浓度的增加，I58qI69Q在逐渐增加，在5-50UM得到线型方程y=0.304+0•038x。[0039]如图3所示，不同干扰物质对比例型荧光传感器的荧光比率值（158〇169〇的影响，BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器具有很强的抗干扰能力和检测尿酸的高度特异性。[0040]如图4所示，本发明的检测结果与现阶段医院临床检测结果一致[0041]从图5可以得出，I58qI69Q=4.4201〜8.4031，说明该传感器在^的浓度为50-300yM范围内响应灵敏。[0042]实例2[0043]1牛血清蛋白--金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1;[0044]2建立BSA-BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器系统：[0045]将步骤⑴得到的BSA-AuAgNCs水溶液、〇PD、HRP加入到磷酸盐缓冲液（10mM，pH二6.0中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。其中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，0PD的浓度为50uM;HRP的浓度为10ngmL。[0046]加入H202,得到158〇169。=4.4201[0047]实例3[0048]1牛血清蛋白-金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1;[0049]2建立BSA-BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器系统：[0050]将步骤⑴得到的BSA-AuAgNCs水溶液、〇PD、HRP加入到磷酸盐缓冲液（10mM，pH=6.0中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。其中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，OPD的浓度为200uM;HRP的浓度为10ngmL。[0051]加入H2O2,得到l58〇l69〇=7.4580[0052]实例4[0053]1牛血清蛋白-金银合金纳米簇水溶液的制备步骤同实施例1;[0054]2建立BSA-BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器系统：[0055]将步骤⑴得到的BSA-AuAgNCs水溶液、〇PD、HRP加入到磷酸盐缓冲液（10mM，pH=6.0中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。其中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，0PD的浓度为300yM;HRP的浓度为1OngmL。[0056]加入H202，得到158。169。=5•9094。

权利要求：1.一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：⑴制备牛血清蛋白--金银合金纳米簇BSA-AuAgNCs水溶液，备用；2建立BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器:将步骤（1得到的BSA-AuAgNCs水溶液、〇ro、HRP加入到稀释液磷酸盐缓冲液中，得到BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器。2.如权利要求1所述的一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑵中，所述BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，BSA-AuAgNCs的浓度为20nM，0PD的浓度为50〜300uM;HRP的浓度为10ngmL。3.如权利要求1所述的一种BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤⑵中，所用磷酸盐缓冲液浓度为l〇mM，pH=6•0。4.将权利要求1所述制备方法制得的BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器用于检测尿酸的用途。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，利用BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器检测尿酸的方法，包括如下步骤：1尿酸酶催化尿酸生成H2〇2;2将步骤⑴制得的H2O2加入BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，反应温度为25〜50°C，时间为10〜60分钟;检测其荧光强度，580nm处荧光强度为I_，69〇nm处荧光强度为1690,得出l58〇l690;3配置一系列不同浓度的尿酸，经尿酸酶催化后，加入BSA-AuAgNCsOPDHRP比例型荧光传感器中，反应完全后检测产物荧光，根据不同浓度的尿酸对应的荧光信号强度得到一系列的〗58〇1690，建立标准曲线。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，步骤（1中，催化pH为4〜8;催化时间为10〜60分钟;催化温度为25〜50°C;尿酸酶含量为5〜200ugmL。

百度查询： 江苏大学 一种BSA-Au/Ag NCs/OPD/HRP比例型荧光传感器的制备方法和用途

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