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申请/专利权人：勃林格殷格翰动物保健美国公司;金维克股份有限公司;由国土安全部部长所代表的美利坚合众国政府

摘要：本发明包括FMDV疫苗或组合物。本发明包括编码和表达FMDV抗原、表位或免疫原的重组载体，其可用于保护动物特别是绵羊、牛、山羊或猪免受FMDV感染。

主权项：1.一种包含表达口蹄疫病毒FMDV抗原的重组病毒载体的组合物或疫苗，其中所述FMDV抗原包含由SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列组成的多肽。

全文数据：以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗及其用途[0001]本发明是在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。[0002]相关申请的交叉引用[0003]本申请要求2016年1月29日提交的美国临时申请62288，540的优先权。发明领域[0004]本发明涉及用于对抗动物中口蹄疫病毒FMDV感染的组合物。本公开提供了包含FMDV抗原的药物组合物，针对FMDV的疫苗接种方法，以及用于此类方法和组合物的试剂盒。[0005]发明背景[0006]口蹄疫FMD是影响农场动物的最具毒性和传染性的疾病之一。该病在世界上许多国家特别是在非洲、亚洲和南美洲流行。另外，流行病爆发可定期发生。该疾病在一个国家的存在可能会因受感染畜群的生产力下降、体重和产奶量下降以及对这些国家实施的贸易禁运而造成非常严重的经济后果。针对这种疾病所采取的措施包括严格的进口限制申请、卫生控制和检疫、屠宰患病动物以及作为国家或地区一级的预防措施或定期（当发生疫情爆发时）使用疫苗的疫苗接种计划。[0007]FMD的特征在于其短潜伏期、其高度传染性、溃疡在口腔中和足部上的形成以及有时幼小动物的死亡。FMD影响许多动物物种，特别是牛、猪、绵羊和山羊。造成该疾病的病原体是属于小RNA病毒科Picornaviridae的口蹄疫病毒属Aphthovirus的核糖核酸RNA病毒Cooper等，Intervirology，1978，10，165-180。目前，已知至少有七种类型的口蹄疫病毒FMDV:欧洲类型A、0和C、非洲类型（SAT1、SAT2和SAT3和亚洲类型亚洲1。还已区分出许多亚型（Kleid等Science1981,214,1125-1129〇[0008]FMDV是直径约25nm的裸二十面体病毒，其含有由约8500个核苷酸组成的单链RNA分子，具有正极性。该RNA分子包含单个开放阅读框ORF，编码含有衣壳前体也称为蛋白Pl或P88以及其它蛋白的单个多蛋白。蛋白Pl在其氨基末端被肉豆蔻酰化。在成熟过程，蛋白Pl被蛋白酶3C切割成称为VP0、VP1和VP3或分别为1AB、1D和lC;BelshamG.J.,ProgressinBiophysicsandMolecularBiology，1993,60,241-261。在病毒体中，蛋白VPO则被裂解成两种蛋白质VP4和VP2或分别为IA和1B。蛋白VPO至VP4和VP2的转化以及成熟病毒体的形成的机制是未知的。蛋白VPI、VP2和VP3具有约26，OOODa的分子量，而蛋白VP4较小，约8,OOODa0[0009]衣壳蛋白的简单组合形成原体protomer或5S分子，其是FMDV衣壳的基本组成部分。然后将该原体复合成五聚体以形成12S分子。病毒体由基因组RNA分子的衣壳化通过12个12S五聚体的组装产生，从而构成146S颗粒。病毒衣壳也可以在RNA分子不存在于其内的情况下形成下文称为“空衣壳”）。空衣壳也称为颗粒70S。空衣壳的形成可在病毒复制期间天然发生或可通过化学处理人工产生。[0010]已对天然空衣壳进行了一些研究。具体地，Rowlands等（Rowlands等，J.Gen.Virol.，1975,26,227-238已显示AlO口蹄疫病的病毒体主要包含四种蛋白质VP1、VP2、VP3和VP4。相比之下，天然空衣壳（不是通过重组获得而是从AlO口蹄疫病毒的培养物中纯化的）基本上含有未切割的蛋白质VP0;对于A-Pando口蹄疫病毒，RweyemamuRweyemamu等，ArchivesofVirology,1979,59,69-79描述了相同的结果。在Tris-EDTA存在的情况下透析后并在离心后获得的人造空衣壳不含蛋白VP4。根据Rowlands等的说法，这些人工衣壳具有轻微的免疫原性，并且天然空衣壳只有在用甲醛处理以稳定它们后才具有免疫原性，而在豚鼠中通过天然空衣壳诱导的抗体反应是不稳定的，如作者所指出的。此夕卜，Rowlands等和Rweyemamu等不认同需要稳定天然空衣壳。Rweyemamu等认为，不用甲醛处理不会损害天然空衣壳的抗原性水平。只有在豚鼠中通过诱导中和抗体才能测试免疫原性。[0011]将通过重组杆状病毒在昆虫细胞中进行的编码衣壳蛋白的前体Pl的基因的表达与编码与蛋白酶3C相关的Pl的基因在大肠杆菌E.coli中的表达进行比较Grubman等，Vaccine,1993,11，825-829;Lewis等，J.Virol·，1991,65,6572-6580Al和3C在大肠杆菌中的共表达导致空衣壳70S的组装。这两种构建体的表达产物在豚鼠和猪中产生中和抗体。用Pl杆状病毒构建获得的滴度低。这些相同的表达产物在猪中诱导部分保护。然而，一些被保护而免受该疾病侵害的猪不能防止攻击性病毒的复制。然而，大肠杆菌表达系统不会使蛋白质肉豆蔻酰化，并且蛋白酶3C对该细胞有毒。Lewis等得出以下结论:与在动物中获得最大保护作用所需的病毒构成和衣壳结构相关的基本问题尚未得到解答。此外，Grubman等指出，在配制疫苗之前必须稳定空衣壳;在这一点上，他们同意通过从病毒培养物中提取获得的空衣壳所遇到的问题见上文）。[0012]含有部分或全部蛋白Pl的融合蛋白也可通过使用病毒载体（即疱瘆病毒或痘苗病毒获得。CA-A-2，047，585特别地描述了用于产生融合蛋白的牛疱瘆病毒，所述融合蛋白含有与该牛疱瘆病毒的糖蛋白gpIII融合的口蹄疫病毒的肽序列Pl的氨基酸141至158结合于Pl的氨基酸200至213。腺病毒载体也已被用于表达FMDV空病毒衣壳US8,323,663。病毒载体也已被用于表达稳定化的?1«^空衣壳1^7,531，182，1^3附4863，181。最近，植物和昆虫细胞已被研究来作为生产FMDV抗原的来源US20110236416，USSN14863，181。[0013]据报道，母源抗体（MDA能够抑制小牛（2岁以下的牛）对FMD疫苗接种的反应Graves,1963,JournalofImmunology91:251-256;Brun等，1977,DevelopmentsinBiologicalStandardisation,25:117-122〇[0014]发明概述[0015]提供了包含表达FMDV多肽及其片段和变体的重组病毒载体的组合物或疫苗。FMDV抗原及其片段和变体具有免疫原性和保护性性质。重组病毒载体可以是表达FMDV抗原的腺病毒载体。[0016]可将重组病毒载体配制成疫苗和或药物组合物。此类疫苗或组合物可用于接种动物并提供免受同源和异源FMDV毒株感染的保护作用。用药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物配制的疫苗或组合物提供热稳定性改善和处理温度偏移的能力。[0017]提供了在常规动物和母源抗体阳性MDA阳性动物中增强抗FMDV感染的保护作用的方法。还提供了包含至少一种抗原多肽或其片段或变体的试剂盒和使用说明书。[0018]附图简述[0019]通过实例给出的但不旨在将本公开仅限于所描述的特定实例的以下详细描述，可以结合附图来最好地理解，其中：[0020]图1描述概述DNA和蛋白质序列的表格。[0021]图2描述嵌合A24-A12构建体中使用的FMDVA24株的基因和A24pl-2AB’）基因。[0022]图3描述嵌合A24-A12构建体中使用的FMDVA12株的基因和A123B’3C基因。[0023]图4描述通过PCR对以重组腺病毒为载体的A24-A12FMDV疫苗进行的遗传结构同一*性测定。[0024]图5描述以重组腺病毒为载体的A24-A12FMDV疫苗的免疫印迹。[0025]图6描述用于以重组腺病毒为载体的FMDVOlM疫苗的FMDVOlM株的基因。[0026]图7描述用于以重组腺病毒为载体的FMDVIrn疫苗的FMDVIrn株的基因。[0027]图8描述用于以重组腺病毒为载体的FMDVAsia疫苗的FMDVAsia株的基因。[0028]图9描述不同剂量的0血清型FMDV疫苗的保护百分比。[0029]图10描述不同剂量的0血清型FMDV疫苗的血清学。[0030]图11描述以重组腺病毒为载体的FMDV+佐剂在25°C下的杀病毒活性。[0031]图12描述以重组腺病毒为载体的FMDV+佐剂在4°C下的杀病毒活性。[0032]图13描述FMDVVN滴度的几何平均值。[0033]图14描述SAV滴度的几何平均值。[0034]图15描述FMDVVN滴度的几何平均值。[0035]详述[0036]提供了包含表达FMDV抗原的重组病毒载体的组合物或疫苗，所述FMDV抗原在动物中引发免疫原性应答。重组病毒载体可以是表达FMDV抗原的腺病毒载体。可将表达抗原的重组病毒载体配制成疫苗或药物组合物，用于在动物中引发或刺激保护性反应。在一个实施方案中，多肽抗原是FMDV结构蛋白PlVP4-VP2-Vp3-VPl、非结构蛋白P22A、2B和2C或非结构蛋白P33A、3B、3C和3D或者其活性片段或变体。[0037]应当认识到本公开的抗原多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”意指片段或变体保留多肽的抗原性质。因此，本公开涵盖在动物中引发免疫原性应答的任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原，诸如但不限于蛋白质、肽或其片段或变体，其在动物如绵羊、牛、山羊或猪中引发、诱导或刺激响应。[0038]衣壳蛋白的简单组合形成原体或5S分子，其是FMDV衣壳的基本组成部分。然后将该原体复合成五聚体以形成12S分子。病毒体由基因组RNA分子的衣壳化通过12个12S五聚体的组装产生，从而构成146S颗粒。病毒衣壳也可以在RNA分子不存在于其内的情况下形成下文称为“空衣壳”）。空衣壳也称为颗粒70S。空衣壳的形成可在病毒复制期间天然发生或可通过化学处理人工产生。[0039]本公开涉及牛、绵羊、山羊或猪的疫苗或组合物，所述疫苗或组合物可包含有效量的重组FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，以及药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。[0040]在一些实施方案中，疫苗还包含佐剂，诸如美国专利7,371，395中描述的水包油0W乳液。[0041]在其他实施方案中，佐剂包括TS6、TS7、TS8和TS9乳液、LR3、LR4和LR6乳液、LF2乳液、CARBIGEN™佐剂、ENABL®佐剂、聚丙烯酸、氢氧化铝或磷酸铝、阜苷、CpG、油包水乳液和水包油乳液，或其组合。[0042]在一些实施方案中，动物中的应答是保护性免疫反应。[0043]“动物”意指哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马科动物例如马）、犬科动物例如，狗、狼、狐狸、效狼、豺）、猫科动物例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物和其他猫科动物包括猎豹和山猫）、羊例如，绵羊）、牛族动物例如，牛、母牛）、猪例如，猪pig、山羊caprine例如，山羊）、禽类例如，鸡、鸭、鹳、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸和食火鸡）、灵长类动物例如、原猴类、眼镜猴、猴子、长臂猿、猿和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段包括胚胎和胎儿阶段）的个体动物。[0044]除非另外解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个种a”、“一个种an”和“该the”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。[0045]本公开的抗原性多肽能够保护免于FMDV。也就是说，它们能够刺激动物的免疫反应。“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特定免疫反应的物质。抗原可包括整个生物体杀死的、减毒或活的）；生物体的亚单位或部分;含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体;能够在呈递给宿主动物时诱导免疫反应的DNA碎片或片段;多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。[0046]如本文中所用，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”包括在以下意义上具有免疫活性的多肽:一旦施用于宿主，其能够引起针对该蛋白质的体液和或细胞类型的免疫反应。在一些实施方案中，蛋白质片段具有与总蛋白质基本相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段可包含至少一个表位或抗原决定簇组成，或者基本上由其组成或由其组成。如本文中所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位、因此引发上述免疫反应的蛋白质的片段。可使用许多表位作图技术鉴定此类片段。例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成大量肽所述肽对应于蛋白质分子的部分），并使所述肽与抗体反应（同时使肽仍然附着在支持物上来确定。此类技术是本领域已知的，并描述于例如美国专利4,708,871;Geysenet等1984，PNASUSA，8113:3998-400;Geysen等，1985，PNASUSA，821:178-82中。类似地，通过确定氨基酸的空间构象诸如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振），可以容易地鉴定构象表位。特别适用于小泰勒虫（T.parva的蛋白质的方法描述于PCTUS2004022605中。[0047]如所讨论的，本公开涵盖抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”还考虑了对序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫反应的作用即可。术语“保守变异”表示用另一种生物学上相似的残基替代氨基酸残基，或替换核酸序列中的核苷酸，使得编码的氨基酸残基不改变或为另一种生物学上相似的残基。在这方面，一些取代通常在性质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：（1酸性一天冬氨酸和谷氨酸；（2碱性一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3非极性一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和⑷不带电的极性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一种疏水性残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一种疏水残基的取代，或一种极性残基对另一种极性残基的取代，诸如精氨酸对赖氨酸的取代、谷氨酸对天冬氨酸的取代、谷氨酰胺对天冬酰胺的取代等;或用结构相关的氨基酸对氨基酸的类似保守取代，所述取代不会对生物活性产生重大影响。因此，具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列，但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的少量氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义范围内。本文包括通过这些修饰产生的所有多肽。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲本氨基酸，条件是针对所述取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。[0048]术语“表位”是指特定B细胞和或T细胞响应于其的抗原或半抗原上的部位。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一种抗体对祀抗原结合的能力。[0049]针对组合物或疫苗的“免疫反应”是在宿主中产生针对目标组合物或疫苗的细胞和或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下效应中的一种或多种:特异性针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，以增强对新感染的抵抗力和或减轻疾病的临床严重度。此类保护作用将通过由感染的宿主通常显示的症状的减轻或缺乏、更快的恢复时间和或感染的宿主中的降低的病毒滴度来证明。[0050]合成抗原也包括在定义内，例如，多表位、侧翼表位和其他重组或合成衍生的抗原。用于本公开目的的免疫原性片段通常将包括分子的至少约3个氨基酸，至少约5个氨基酸，分子中至少约10-15个氨基酸，或约15-25个氨基酸或更多氨基酸。片段长度没有严格的上限，其可包含蛋白质序列的几乎全长，或甚至包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。[0051]因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码FMDV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。编码FMDV多肽的片段的多核苷酸可包含编码该多肽的序列的最少15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75个或至少57个、87个或150个连续或毗连的核苷酸，或基本上由所述序列组成或由所述序列组成。[0052]术语“核酸”和“多核苷酸”是指为线性或支链的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。该术语还包括RNADNA杂交体。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段、夕卜显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团诸如氟代核糖和硫醇盐酯，以及核苷酸分支。核苷酸的序列可在聚合后被标记组分进一步修饰，例如缀合。包括在该定义中的其他类型的修饰是帽，类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代，以及用于将多核苷酸附接至蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体上的方式的引入。多核苷酸可通过化学合成获得或来源于微生物。[0053]术语“基因”被广泛用于指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包含内含子和外显子如在基因组序列中），或仅包含编码序列（如在cDNA中）和或其表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调控序列。[0054]本公开还包括编码FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可以是多聚体并且具有任何长度，并且可包含任意组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。[0055]术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指具有任意长度的氨基酸残基聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，其可被除氨基酸外的化学部分中断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预（例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记或生物活性组分的缀合修饰的氨基酸聚合物。[0056]“分离的”生物组分诸如核酸或蛋白质或细胞器是指已经与其中天然存在所述组分的生物体的细胞中的其他生物组分例如，其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器实质上分离或纯化出来的组分。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。[0057]如本文中所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度;相反，其旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽制剂是所述多肽在其中比所述多肽在其天然环境中更加富集的制剂。在一些情况下，多肽与细胞组分分离。“基本上纯化的”意指所述多肽代表至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%或更多的细胞组分或材料已被除去的几个实施方案。同样，多肽可以是部分纯化的。“部分纯化的”意指除去少于60%的细胞组分或材料。这同样适用于多核苷酸。本文公开的多肽可以通过本领域已知的任何方法纯化。[0058]如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是FMDV抗原多肽，其由病毒载体在体内产生。所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的多肽也包括在本公开中。“片段”意指多核苷酸的一部分或由其编码的抗原性氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，因此具有如本文其他地方所述的免疫原性活性。多肽序列的片段保留了在动物中诱导保护性免疫反应的能力。[0059]“变体”旨在表示基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失和或添加和或天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的取代。如本文中所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本公开的特定多核苷酸例如参考多核苷酸的变体也可通过比较变体多核苷酸编码的多肽与参考多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评估。“变体”蛋白质意指通过在天然蛋白质中的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸和或在天然蛋白质中的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸而衍生自天然蛋白质的蛋白质。本公开涵盖的变体蛋白质具有生物学活性，即它们具有引发免疫反应的能力。[0060]在一个方面，本公开提供来自绵羊、牛、山羊或猪FMD分离株的FMDV多肽。在另一方面，本公开提供了具有SEQIDN0:2、4、6或8中所示序列的多肽及其变体或片段。[0061]此外，来自绵羊、牛、山羊或猪的FMDV多肽的同系物旨在本公开的范围内。如本文中所用，术语“同系物”包括直向同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能但在不相关生物中分别进化的两种多核苷酸或多肽。术语“直向同源物”是指来自不同物种，但通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常，直向同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型FMDV多肽的类似物、直向同源物和旁系同源物可与野生型FMDV多肽在翻译后修饰、氨基酸序列差异或两方面不同。特别地，本公开的同系物通常表现出与野生型FMDV多肽或多核苷酸序列的全部或部分至少80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，并将表现出类似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化以及存在于天然群体例如，病毒种类或品种）中。这种天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽的1-5%的变异。可通过对许多不同物种中的目标核酸序列进行测序来鉴定等位基因变体，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中的相同基因的基因座来容易地进行。任何和所有此类核酸变异和由天然等位基因变异导致的并且不改变目标基因的功能活性的所得氨基酸多态性或变异均在本公开的范围内。[0062]如本文中所用，术语“衍生物”或“变体”是指多肽或编码多肽的核酸，其具有一个或多个保守氨基酸变异或其他微小修饰，因此⑴当与野生型多肽相比时，相应的多肽具有基本上等同的功能，或⑵针对该多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括具有FMDV多肽一级氨基酸序列的微小修饰的多肽，其可以产生与未修饰的对应多肽相比具有基本相同的活性的肽。此类修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或可以是自发的。术语“变体”还涵盖了序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫反应的作用。[0063]术语“保守变异”表示用另一种生物学上相似的残基替换氨基酸残基，或替换核酸序列中的核苷酸，使编码的氨基酸残基不改变或成为另一种生物学上相似的残基。在这方面，如上所述，特别优选的取代通常在性质上是保守的。[0064]本公开的多核苷酸包括由于遗传密码而简并的序列，例如特定宿主的优化的密码子用法。如本文中所用，“优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码FMDV多肽的优化多核苷酸，可修饰FMDV蛋白基因的DNA序列以1包含特定物种中高表达基因偏爱的密码子;2在核苷酸碱基组成中包含达到基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量的A+T或G+C含量;3形成所述物种的初始序列；或4消除导致去稳定、不适当的多腺苷酸化、RNA的降解和终止的序列，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物中或特定物种中密码子用法的分布频率，可在所述物种中实现FMDV蛋白表达的增加。术语“优选密码子用法的频率”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定给定的氨基酸时表现出的偏爱。存在20种天然氨基酸，其中大多数由不止一个密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的FMDV多肽的氨基酸序列在功能上不变，所有简并核苷酸序列均包括在本公开中。[0065]可使用标准参数（参见，例如，可在“美国国家生物技术信息中心”（NCBI，BetheSda，Md.，USA服务器上获得的BLAST或BLASTX算法），通过NCBI美国国家生物技术信息中心成对blast和bl〇Sum62矩阵来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。[0066]关于序列的“同一性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以两个序列中较短序列的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可以根据Wilbur和Lipman算法1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，第726-730页来确定。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用VectorNTI软件包Invitrogen,1600FaradayAve.,Carlsbad,CA来确定。当说RNA序列相似，或者与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷⑺被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶⑹。因此，RNA序列在本公开的范围内，并且可通过将DNA序列中的胸苷T被视为等于RNA序列中的尿嘧啶⑹而从DNA序列导出。[0067]杂交反应可在不同“严格度”的条件下进行。参见例如“MolecularCloning:ALaboratoryManual”，第4版（Sambrook等，2014。[0068]本公开内容还包括载体分子或表达载体中包含的并且可操作地连接至启动子元件和任选地增强子的FMDV多核苷酸。[0069]“载体”是指包含待被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。出于预防或治疗的目的，异源多核苷酸可包含目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。[0070]术语“重组”意指半合成或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未发现的排列与另一多核苷酸连接。[0071]“异源的”意指源自与同其进行比较的实体的其余部分在遗传上不同的实体。例如，可通过基因工程技术将多核苷酸置于来源于不同来源的质粒或载体中，从而所述多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。[0072]本公开涉及绵羊、牛、山羊和猪的疫苗或药物或免疫组合物，其可包含有效量的重组FMDV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或媒介物。[0073]本文所述的主题部分涉及与杆状病毒昆虫细胞表达系统中制备的FMDV抗原相关的组合物和方法，所述FMDV抗原具有高免疫原性并保护动物免受同源和异源FMDV株的攻击。[0074]组合物[0075]本公开涉及FMDV疫苗或组合物，其可包含有效量的重组FMDV抗原和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。在一个实施方案中，FMDV疫苗或组合物包含表达FMDV抗原的重组病毒载体。[0076]本公开的一个实施方案涉及包含表达FMDV抗原的病毒载体的疫苗或组合物。通过表达区域PlVP4-VP2-VP3-VP1、2A2B’3B’和3C或PlVP4-VP2-VP3-VP1、2A2B2C和3A3B3C3D的cDNA获得FMDV抗原。结构区域Pl和非结构区域P2或P3可以源自相同的FMDV血清型或不同的血清型嵌合抗原）。[0077]本公开包括在动物诸如绵羊、牛、山羊或猪）中引发免疫原性反应的任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于蛋白质、肽或其片段，其在动物诸如绵羊、牛、山羊或猪）中引发、诱导或刺激应答。[0078]在其中FMDV免疫组合物或疫苗是重组免疫组合物或疫苗的一个实施方案中，组合物或疫苗包含重组载体和药学或兽医学上可接受的赋形剂、载体、佐剂或媒介物;重组载体是杆状病毒表达载体，其可包含编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是¥?1、¥?2、¥?3、¥?4、2六、28、2：、34、38、3：或30，或其任意组合。[0079]在一个实施方案中，PlVP4-VP2-VP3-VP1-2A部分2B部分3B和3C多肽可以在病毒载体中表达，并且表达可由一种或多种启动子序列调控。在另一个实施方案中，FMDV抗原可以是嵌合抗原，其包含来自FMDV血清型A24的PlVP4-VP2-VP3-VP1-2A-部分2B和来自FMDV血清型A12的部分3B和来自FMDV血清型A24的3C抗原。在另一个实施方案中。FMDV抗原可以是PlVP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-部分2C-部分3A-3B-3C。[0080]在另一个实施方案中，FMDV抗原可来源于FMDV01Manisa、01BFS或Campos、A24CruzeiroNAl2NAsialShamir、AIran,96NAsiaIRN05NA22Iraq、SAT2SaudiArabia。[0081]本公开涉及FMDV疫苗，其可包含有效量的重组FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，以及药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。[0082]在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳液。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是水包油乳液。[0083]本公开还包括载体分子或表达载体中包含的并且与启动子元件和任选地增强子可操作地连接的FMDV多核苷酸。[0084]在一个方面，本公开提供了FMDV多肽，特别是具有SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列的绵羊、牛、山羊或猪的多肽及其变体或片段。[0085]在另一方面，本发明提供了与本公开的抗原性多肽，特别是与具有SEQIDN0:2、4、6或8所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。[0086]在另一个方面，本公开提供了上文鉴定的FMDV多肽的片段和变体SEQIDN0:2、4、6或8，其可以由本领域技术人员使用分子生物学技术容易地制备。[0087]变体是具有与SEQIDN0:2、4、6或8所示的氨基酸序列具有至少75%,80%,85%，90%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列的同源多肽。[0088]FMDV多肽的免疫原性片段包括具有SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列的FMDV多肽或其变体的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，FMDV多肽的片段包括在全长FMDV多肽上发现的特定抗原表位。[0089]在另一方面，本公开提供了编码FMDV多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面，本公开提供了编码与具有SEQIDNO:2、4、6或8所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽或保守变体、等位基因变体、同源物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段或这些多肽的组合的多核苷酸。[0090]在另一方面，本公开提供了具有SEQIDNO:1、3、5或7所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一方面，本公开提供了与具有SEQIDNO:1、3、5或7所示序列的多核苷酸之一具有至少70%，至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多核苷酸，或其变体。[0091]本公开的多核苷酸可包含额外的序列，诸如相同转录单位内的另外的编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、增强子、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子的控制下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及诸如对于提供本公开的实施方案可能比较理想的任何此类构建体。[0092]用于表达FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。以最小的方式，其包含起始密码子ATG、终止密码子和启动子，以及对于某些载体诸如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒外的病毒载体任选地还有多聚腺苷酸化序列，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多蛋白片段例如FMDV肽时，有利地，在载体中，将ATG置于阅读框的5’并将终止密码子置于3’。可以存在用于控制表达的其他元件，诸如增强子序列、稳定化序列，诸如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。[0093]本公开还涉及包含载体诸如表达载体的制剂，例如治疗性组合物。制剂可包含一种或多种载体，例如表达载体，诸如体内表达载体，其包含并表达一种或多种FMDV多肽，抗原，表位或免疫原。在一个实施方案中，所述载体在药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中包含并表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码并且有利地表达FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸，基本上由所述多核苷酸组成或由所述多核苷酸组成。因此，根据本公开的一个实施方案，制剂中的另外的一种或多种载体包含多核苷酸，基本上由所述多核苷酸组成，或由所述多核苷酸组成，所述多核苷酸编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种其它蛋白质或其片段，并且在适当的情况下表达其。[0094]根据另一个实施方案，制剂中的一种或多种载体包含编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其片段的多核苷酸、表达所述多核苷酸的一种或多种载体，或基本上由所述多核苷酸或载体组成，或由所述多核苷酸或载体组成。在另一个实施方案中，所述制剂包含一种、两种或更多种载体，所述载体包含编码且有利地体内表达FMDV多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。本公开还涉及包含编码并表达不同FMDV多肽、抗原、表位或免疫原，例如来自不同动物物种储如，但不限于绵羊、牛、山羊或猪）的FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的表达载体的混合物。[0095]根据本公开的另一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体的非限制性实例中，PVR1020或1012质粒VICAL，Inc.;Luke等，1997;Hartikka等，1996，HumGeneTher,710:1205-17;参见，例如，美国专利：5,846,946和6，451，769可用作载体用于插入多核苷酸序列。pVR1020质粒衍生自pVR1012并含有人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含Genbank中登录号HUMTPA14下的氨基酸M⑴至氨基酸S23。在另一个具体的非-限制性实例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可含有Genbank中登录号U28070下的氨基酸M24至氨基酸A48的马IGFl的信号肽序列。关于可在实践中查询或应用的DNA质粒的附加信息可见于例如美国专利6，852,705、6，818,628、6,586,412、6,576,243、6,558,674、6,464,984、6,451，770、6,376,473和6,221，362〇[0096]术语质粒包括任何DNA转录单位，其包含根据本公开的多核苷酸和其在所需宿主或革G标的一种或多种细胞中体内表达所必需的元件;并且，在这方面应注意，超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式旨在落入本公开的范围内。[0097]除了编码FMDV抗原、表位或免疫原任选地与异源肽序列融合）的多核苷酸以外，质粒还可包含或含有与启动子可操作地连接的或在启动子的控制下或依赖于启动子的编码变体、类似物或片段的多核苷酸，或基本上由所述多核苷酸组成。通常，使用在真核细胞中有功能的强启动子是有利的。强启动子可以是但不限于人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子CMV-IE，或任选地具有另一种来源诸如大鼠或豚鼠的启动子，Super启动子Ni，Μ.等，PlantJ.7,661-676,1995.XMV-IE启动子可以包含实际的启动子部分，其可以与或可以不与增强子部分相连接。可以参考EP-A-260148、EP-A-323597、美国专利：5，168，062、5,385,839和4,968,615，以及？：1'申请号冊8703905。在一些实施方案中，01^-比启动子是人CMV-IEBoshart等，1985,Cell,412:521-30或鼠CMV-IE。[0098]更一般而言，启动子是病毒、植物或细胞来源。可在本公开的实践中使用的除CMV-IE外的强病毒启动子是SV40病毒的早期晚期启动子或劳氏肉瘤病毒的LTR启动子。可用于实施本公开的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，诸如，例如结蛋白启动子Kwissa等，2000,Vaccine，1822:2337-44或肌动蛋白启动子Miyazaki等，1989,Gene，792:269-77〇[0099]质粒可包含其他表达控制元件。特别有利的是掺入稳定化序列，例如内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶内含子Callis等GenesDev.l10:1183-1200，Dec.l987、hCMV-IE的第一内含子PCT申请号TO198901036、兔β-珠蛋白基因的内含子IIvanOoyen等，1979，Science，2064416:337-44。在另一个实施方案中，质粒可包含3’UTL3’UTR可以是但不限于土壤杆菌（agrobacterium胭脂碱合成酶（Nos3’UTRNopalinesynthase:transcriptmappingandDNAsequence·Depicker，A·等J·Mol·Appl·Genet·，1982;Bevan1NAR,1984,1222:8711-8721〇[0100]关于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多聚腺苷酸化信号polyA，可以更多地使用牛生长激素bGH基因（参见US5,122,458的polyA信号或兔β-珠蛋白基因的poly㈧信号或SV40病毒的poly⑷信号。[0101]“宿主细胞”表示已被遗传改变，或者能够通过施用外源多核苷酸诸如重组质粒或载体进行遗传改变的原核或真核细胞。当提及遗传改变的细胞时，该术语指最初改变的细胞及其后代。[0102]在一个实施方案中，重组FMDV抗原在昆虫细胞中表达。[0103]使用方法[0104]在一个实施方案中，本文公开的主题涉及对绵羊、牛、山羊或猪进行疫苗接种的方法，其包括向绵羊、牛、山羊或猪施用有效量的疫苗，所述疫苗可包含表达FMDV抗原的重组病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。[0105]在本公开的一个实施方案中，所述方法包括单次施用用根据本公开的乳液配制的疫苗组合物。例如，在一个实施方案中，免疫学或疫苗组合物包含表达FMDV抗原的重组病毒载体。[0106]在本公开的另一个实施方案中，该方法包括单次施用两种异源疫苗组合物。异源疫苗或组合物可以是不同类型的疫苗，诸如FMDVVLP疫苗或FMDV病毒载体疫苗。异源疫苗也可以是表达不同FMDV血清型（诸如A24、A12、01Manisa、Asia和Iraq株）的衣壳的相同类型的疫苗。[0107]在一个实施方案中，本文公开的主题涉及对绵羊、牛、山羊或猪进行疫苗接种的方法，其包括向绵羊、牛、山羊或豚鼠施用疫苗，所述疫苗包含体内表达FMDV抗原的重组病毒载体。[0108]在一个实施方案中，本文公开的主题涉及引发免疫反应的方法，其包括向绵羊、牛、山羊或猪施用包含体内表达FMDV抗原的重组病毒载体的疫苗。[0109]同源和异源FMDV株均用于攻击以测试疫苗的功效。施用可以以皮下或肌内进行。施用可以是无针的（例如Pigjet或Bioject。[0110]在本公开的一个实施方案中，可使用初免-加强方案，其由使用至少一种共同的多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初次施用和至少一次加强施用组成。初次施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作加强剂的那些不同。然而，应注意，相同的组合物可用作初次施用和加强施用。该施用方案称为“初免-加强”。[0111]根据本公开的初免-加强可包括用于表达FMDV编码序列或编码抗原性多肽或其片段或变体的其片段的重组病毒载体。具体地，病毒载体可表达FMDV基因或编码抗原性多肽的其片段。本文考虑的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒痘苗病毒、禽痘病毒或减毒禽痘病毒（例如，金丝雀痘、鸡痘、鸿痘（dovepox、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC、TROVAC;参见例如美国专利5，505，941和5，494，807、浣熊痘病毒、猪痘病毒等]、腺病毒例如，人腺病毒、犬腺病毒）、疱瘆病毒例如犬疱瘆病毒、火鸡疱瘆病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、猫疱瘆病毒、喉气管炎病毒（ILTV、牛疱瘆病毒、猪疱瘆病毒）、杆状病毒、逆转录病毒等。在另一个实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是金丝雀痘载体，诸如ALVAC。在另一个实施方案中，禽痘表达载体可以是鸡痘载体，诸如TR0VAC。将待表达的本公开的FMDV抗原插入在特定的痘病毒启动子的控制下，所述痘病毒启动子是例如昆虫痘病毒的桑缘灯蛾（Amsactamoorei42K启动子（（Barcena,Lorenzo等，2000，JGenVirol.,814:1073-85、痘苗启动子7.5kDaCochran等，1985,JVirol,54I:30-7、痘苗启动子I3LRiviere等，1992，JVirol，66⑹：3424-34、痘苗启动子HAShida，1986,Virology,150⑵：451-62、牛痘启动子ATIFunahashi等，1988,JGenVirol,69I:35-47、痘苗启动子H6Taylor等，1988,Vaccine,66:504-8;Guo等，1989,JVirol,6310:4189-98;Perkus等，1989,JVirol,63⑼：3829-36.等等。[0112]在另一个实施方案中，鸟痘病毒表达载体可以是金丝雀痘载体，诸如ALVACt3FMDV抗原、表位或免疫原可以是FMDVP1-3GFMDV病毒载体可以是金丝雀痘病毒，诸如VCP2186、VCP2181或VCP2176，或禽痘病毒，诸如VFP2215参见美国专利7，527，960。在另一个实施方案中，可以在浮萍中产生FMDV抗原、表位或免疫原美国公开专利申请20110236416。[0113]在本公开的初免-加强方案的另一个方面，施用包含本公开的FMDV抗原的组合物，然后施用包含由杆状病毒在昆虫细胞中表达的FMDVVLP的亚单位疫苗的疫苗或组合物参见USSN14863,181，或包含FMDV抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或含有或表达FMDV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样，初免-加强方案可包括施用疫苗或组合物所述疫苗或组合物包含含有由杆状病毒在昆虫细胞中表达的FMDVVLP的亚单位疫苗），或含有FMDV抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或含有或表达FMDV抗原的DNA质粒疫苗或组合物，然后施用包含本公开的FMDV抗原的组合物。还应注意，初次和第二次施用均可包含含有本公开的FMDV抗原的组合物。[0114]初免-加强方案包括使用至少一种共同多肽和或其变体或片段的至少一种初次施用和至少一次加强施用。用于初次施用的疫苗在性质上可与用作后来的加强疫苗的疫苗不同。初次施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。[0115]用于哺乳动物目标物种的基于病毒载体例如基于非痘病毒的病毒载体的组合物的剂量体积，例如绵羊、牛、山羊或猪组合物的剂量体积，通常为约0.1至约5.0ml、约0.1至约3.Oml，和约0.5ml至约2.5ml。[0116]疫苗的功效可以在最后一次免疫后约2至4周通过用FMDV的毒性株诸如FMDVOlManisa、01BFSorCampos、A24Cruzeiro、A12、AsiaIShamir、AIran’96、AsiaIRN05、A22Iraq、SAT2SaudiArabia株攻击动物诸如绵羊、牛、山羊或猪来进行测试。[0117]其它株包括FMDV株A10-61、A5、A12、A24Cruzeiro、C3Indaial、01、Cl-SantaPau、Cl-C5、A22550Azerbaijan65、SATl-SAT3、A、ATNC7194、AIND268、AIND377、AIND568、AIND782、AIND1682、AIND1777、AIND1782、AIND1976、AIND2082、AIND2282、AIND2581、AIND2682、AIND5479、AIND5779、AIND7379、AIND8579、AIND8679、AAPA2584、AAPN4184、AAPS4405、AAPS5005、AAPS5505、AAPS6605、AAPS6805、ABM4695、AGUM3384、A0RS6684、A0RS7588、ATNAn60947Asial、AIRN05、AsiaIRN05、0HK2001、0UKG39522001、0UKG41412001、AsialHNKCHA05GenBank登录号EF149010,通过引用并入本文）、AsiaIXJLi,ZhiYong等ChinSciBull,2007、HK70ChinSciBull,2006,5117:2072—2078、0UKG70392001、0UKG91612001、0UKG72992001、0UKG40142001、0UKG49982001、0UKG94432001、0UKG54702001、0UKG56812001，0ES2001、HKN2002、05India、0BKF292、K3784A、KENl76A、GAM5198A、A10Holland、0KEN191、0IND4997、0IND6598、0IND6498、0IND4898、0IND4798、0IND8297、0IND8199、0IND8198、0IND7997、0IND7897、0IND7597、0IND7497、0IND7097、0IND6698、0IND6397、0IND6197、0IND5798、0IND5698、0IND5598、0IND5498、0IND46998、0IND46597、0IND46497、0IND42497、0IND42397、0IND42097、0IND41497、0IND41197、0IND41097、0IND40997、0IND40797、0IND39997、0IND3997、0IND39197、0IND3897、0IND38497、0IND38097、0IND3797、0IND35297、0IND3397、0IND3197、0IND29697、0IND2399、0IND46397、0IND46197、0IND42798、0IND2897、0IND28799、0IND28599、0IND28299、0IND28197、0IND2797、0IND27897、0IND25699、0IND24999、0IND21099、0IND20899、0IND20799、0IND20599、0IND18599、0IND17599、0IND17097、0IND16499、0IND16099、0IND15399、0IND14899、0IND14699、0SKR2000、A22India1777.[0118]这些FMDV株的进一步细节可在欧洲生物信息学信息EMBL-EBI网页上找到，并且所有相关的核苷酸序列通过引入并入本文。本发明人考虑可以根据本公开的教导表达本文列出的所有FMDV株和尚待鉴定的那些株，以产生例如有效的疫苗组合物。同源和异源株均用于攻击以测试疫苗的功效。可以皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内和或口服攻击动物。[0119]初免-加强施用可以有利地间隔1至6周（例如间隔约3周）进行。根据一个实施方案，还设想了有利地使用基于病毒载体的疫苗的半年加强免疫或年度加强免疫annualbooster。在第一次施用时，动物有利地为至少6至8周龄或约6月龄。[0120]包含在初免-加强方案中使用的本公开的重组抗原性多肽的组合物包含在药学上或兽医学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂中。本公开的方案保护动物免受绵羊、牛、山羊或猪FMDV的侵害和或预防受感染的动物的疾病进展。[0121]本领域技术人员应该理解，本文的公开内容是作为示例提供的，并且本公开不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，技术人员可确定施用次数、施用途径和每种注射方案使用的剂量，而无需任何过度的实验。[0122]本公开考虑向动物至少一次施用有效量的根据本公开制备的治疗性组合物。所述动物可以是雄性、雌性、怀孕的雌性和新生儿。该施用可通过各种途径进行，包括但不限于肌内（頂）、皮内（ID或皮下（SC注射或通过鼻内或口服施用。根据本公开的治疗性组合物还可通过无针装置（如，例如，使用Pigjet、Dermojet、Biojector、AvijetMerial，GA，USA、Vetjet或Vitajet装置Bioject,Oregon,USA施用。施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔参见，例如，TolIefsen等，2002;TolIefsen等，2003;Babiuk等，2002;PCT申请号W09901158。在另一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗性组合物递送给动物。[0123]在一个实施方案中，本公开提供了治疗有效量的制剂的施用，所述制剂用于在靶细胞中递送和表达FMDV抗原或表位。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员而言是常规实验。在一个实施方案中，所述制剂包含表达载体和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂，所述表达载体包含表达FMDV抗原或表位的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂促进转染或将多核苷酸转移至宿主动物的其它方式和或改善载体或蛋白质在宿主中的保留。[0124]在一个实施方案中，本文公开的主题提供了用于区分感染的动物与接种疫苗的动物DIVA的检测方法。[0125]本文公开了本公开的疫苗或组合物的使用允许检测动物中的FMDV感染。本文公开了本公开的疫苗或组合物的使用允许通过区分感染与接种疫苗的动物DIVA来检测动物中的感染。本文公开了用于使用FMDV非结构蛋白（例如，FMDV3ABC或3D特异性ELISA诊断动物中FMDV感染的方法。[0126]制品[0127]在一个实施方案中，本文公开的主题涉及用于实施激发或诱导免疫反应的方法的试剂盒，其可包含重组FMDV免疫组合物或疫苗或者灭活的FMDV免疫组合物或疫苗、重组FMDV病毒组合物或疫苗中的任一种和实施该方法的说明书。[0128]本公开的另一个实施方案是用于进行在动物中诱导针对FMDV的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包含含有本公开的FMDV抗原的组合物或疫苗和重组FMDV病毒免疫组合物或疫苗，以及用于进行以有效量递送以在动物中引发免疫反应的方法的说明书。[0129]本公开的另一个实施方案是用于进行在动物中诱导针对FMDV的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包含含有本公开的FMDV抗原的组合物或疫苗和灭活的FMDV免疫组合物或疫苗，以及用于进行以有效量递送以在动物中引发免疫反应的方法的说明书。[0130]本公开的另一方面涉及用于如上所述的根据本公开的初免-加强免疫接种的试剂盒。所述试剂盒可包含至少两个小瓶:第一小瓶，其含有用于根据本公开的初免-接种的疫苗或组合物，和第二小瓶，其含有用于根据本公开的加强-接种的疫苗或组合物。该试剂盒可包含额外的第一个或第二个小瓶，用于额外的初免-接种或额外的加强-接种。[0131]在一个实施方案中，公开了包含FMDV抗原或其片段或变体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物。在另一个实施方案中，公开了包含表达FMDV抗原的重组病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物。在另一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体包含含有绵羊、牛、山羊或猪FMDV抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体被部分纯化的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体被实质上纯化的上述组合物。[0132]在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体是绵羊、牛、山羊或猪FMDV多肽的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV多肽是Pl多肽、VPO多肽、VPl多肽、VP3多肽、VP2多肽、VP4多肽、2A多肽、2B多肽、2C多肽、3A多肽、3B多肽、3C多肽或3D多肽的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体与SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列具有至少80%序列同一性的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原由与SEQIDNO:1、3、5或7所示的序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物是油包水乳液或水包油乳液的上述组合物。在另一个实施方案中，公开了给对绵羊、牛、山羊或猪FMDV易感的动物接种疫苗的方法，其包括向所述动物施用上述组合物。在一个实施方案中，公开了给对绵羊、牛、山羊或猪FMDV易感的动物接种疫苗的方法，其包含初免-加强方案。在一个实施方案中，公开了在昆虫细胞中表达的基本上纯化的抗原性多肽，其中所述多肽包含:与具有SEQIDNO:2、4、6或8所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方案中，动物优选为绵羊、牛、猪或山羊。在一个实施方案中，公开了一种诊断动物中的FMDV感染的方法。在另一个实施方案中，公开了用于初免_加强免疫接种的试剂盒，其包含至少两个小瓶，其中第一小瓶含有包含FMDV抗原或其片段或变体的组合物，第二小瓶包含含有或表达FMDV抗原的重组病毒载体。[0133]药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或佐剂或赋形剂是本领域技术人员公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9%NaCl例如，盐水溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本公开的方法的其他药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚L-谷氨酸或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或佐剂或赋形剂可以是促进载体或在体外从本发明的载体表达的蛋白质）的施用的任何化合物或化合物的组合;有利地，载体、媒介物或赋形剂可促进转染和或改善载体或蛋白质）的保留。在本文中在一般描述中对剂量和剂量体积进行了论述，并且所述剂量和剂量体积也可由本领域技术人员结合本领域的知识阅读本说明书来确定，而无需任何过度的实验。[0134]有利地适用于但不仅仅适用于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的那些阳离子脂质：[0135][0136]其中Rl是具有12-18个碳原子的饱和或不饱和的直链脂族基团，R2是另一个含有2或3个碳原子的脂族基团，X是胺或羟基，例如，DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以与中性脂质例如DOPE缔合。[0137]在这些阳离子脂质当中，优选的是DMRIEN-2-羟乙基-N，N-二甲基-2,3-双（十四烷氧基-1-丙烷铵;W09634109，其有利地与中性脂质（有利地是DOPE二油酰基-磷脂酰-乙醇胺;Behr，1994缔合，以形成DMRIE-D0PE。[0138]有利地，临用前形成，并且有利地与制剂施用的同时形成或在制剂施用前不久形成具有佐剂的质粒混合物;例如，在施用之前不久或施用前，形成质粒-佐剂混合物，从而有利地在施用之前给予足够的时间（例如施用前约10至约60分钟，诸如施用前约30分钟使混合物形成复合物。[0139]当存在DOPE时，DMRIE:DOPE摩尔比为约95:约5至约5:约95，更有利地约1:约1，例如1:1〇[0140]DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂:质粒重量比可为约50:约1至约1:约10，例如约10:约1至约1:约5,以及约1:约1至约1:约2,例如，1:1至1:2。[0141]在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳液。合适的油包水乳液的实例包括在4°C下稳定的并且具有流动性的油基油包水型疫苗乳液，其含有:6至50vv%的含抗原水相，优选12至25vv%、50至94vv%的油相其全部或部分含有非代谢油例如，矿物油诸如石蜡油和或可代谢油例如，植物油、或脂肪酸、多元醇或醇酯）、0.2至20pv%优选3至8pv%的表面活性剂，后者全部或部分为任一种聚甘油酯或存在于所述聚甘油酯的混合物中，所述聚甘油酯优选是聚甘油聚）蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或另外地氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳液中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯例如，聚氧乙烯20脱水山梨糖醇单油酸酯TWEEN80®,购自AppliChem，InC.，Cheshire，CT和脱水山梨糖醇酯例如，脱水山梨糖醇单油酸BHSPAN80®_.,购自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT。另外，关于油包水乳液，另见美国专利6，919,084,例如其实施例8,其通过引用并入本文。在一些实施方案中，含抗原的水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐溶液。合适的缓冲溶液的实例是磷酸盐缓冲盐水。在一个有利的实施方案中，油包水乳液可以是水油水W0W三重乳液US美国专利6，358，500。其它合适的乳液的实例描述于美国专利了7，371，395中。[0142]根据本公开的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由所述佐剂组成。用于实施本公开的合适佐剂是（1丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酸酐的聚合物和烯基衍生聚合物，（2免疫刺激序列（ISS，诸如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列Klinman等，1996，PNASUSA，937:2879-83;TO9816247，⑶水包油乳液，诸如由M.Powell，M.Newman，PlenumPress1995,6:147,183出版的“VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach”的第147页中所描述的SPT乳液，以及同一著作的第183页中描述的乳液MF59,（4含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，（5细胞因子，⑹氢氧化铝或磷酸铝，（7皂苷或8引用的和通过引用并入本申请的任何文献中论述的其他佐剂，或9其任意组合或混合物。[0143]特别适用于病毒载体的水包油乳液⑶可以基于:轻质液体石蜡油欧洲药典型）、类异戊二烯油诸如角鲨烷、角鲨烯、由烯烃例如异丁烯或癸烯的低聚化产生的油、或具有直链烷基的酸或醇的酯诸如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二辛酸酯癸酸酯）、甘油三辛酸酯癸酸酯和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，尤其是异硬脂酸酯。[0144]将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可以是非离子表面活性剂，诸如:一方面是脱水山梨糖醇、甘露醇例如脱水甘露醇油酸酯）、甘油、聚甘油或丙二醇以及另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选地被乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，诸如Pluronic，例如L121。[0145]在类型（1佐剂聚合物中，优选的是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸尤其是通过糖或多元醇的聚稀基醚交联）的聚合物。这些化合物的商品名为卡波姆（carb〇merPharmeuropa，第8卷，第2号，1996年6月）。本领域技术人员还可参考美国专利2,909,462，其提供了通过具有至少三个羟基，优选不超过八个这样的基团的多羟基化合物交联的此类丙烯酸类聚合物，至少三个羟基的氢原子被具有至少两个碳原子的不饱和脂族基团替代。优选基团是含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其他烯键式不饱和基团。不饱和基团也可含有其它取代基诸如甲基。以CARB0P0L®BFG〇〇driCh，0hi〇，USA名称出售的产品是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中可提及的有CARB0P0L®1974P、934P和971P。[0146]关于马来酸酐-链烯基衍生物共聚物，优选的是EMA®Monsanto，其为直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，并且它们例如通过二乙烯基醚交联。[0147]关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和优选由具有下式的基本单元形成：[0149]其中：[0150]-Rl和R2可以相同或不同，代表H或CH3[0151]-x=〇或1，优选χ=ι[0152]-y=i或2，x+y=2。[0153]对于ΕΜΑ'χ=〇且y=2,对于卡波姆x=y=l。[0154]这些聚合物可溶于水或生理盐溶液（20glNaCl中，并且可以例如通过苏打NaOH将pH调节至7.3至7.4,以提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。最终的免疫组合物或疫苗组合物中的聚合物浓度范围可以为约〇.〇1至约1.5%wv，约0.05至约1%wv，和约〇·1至约CL4%wv。[0155]—种或多种细胞因子5可在免疫组合物或疫苗组合物中以蛋白质形式存在，或者可在宿主中与一种或多种免疫原或其表位共表达。优选的是通过与表达一种或多种免疫原或其表位的载体相同的载体，或通过其单独的载体进行的一种或多种细胞因子的共表达。[0156]本公开包括制备此类组合组合物;例如，通过将活性组分有利地与佐剂、载体、细胞因子和或稀释剂混合在一起。[0157]可用于本公开的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、干扰素aIFNa、干扰素βIFNP、干扰素γIFNγ、白细胞介素-laIL-Ia、白细胞介素-1βIL-Ιβ、白细胞介素-2IL-2、白细胞介素-3IL-3、白细胞介素-4IL-4、白细胞介素-5IL-5、白细胞介素-6IL-6、白细胞介素-7IL-7、白细胞介素-8IL-8、白细胞介素-9IL-9、白细胞介素-10IL-IO、白细胞介素-11IL-11、白细胞介素-12IL-12、肿瘤坏死因子aTNFa、肿瘤坏死因子PTNFP、聚肌苷酸和聚胞苷酸、胞苷-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸CpGODN和转化生长因子βTGF®。应当理解，可将细胞因子与本公开的免疫组合物或疫苗组合物共同施用和或顺序施用。因此，例如，本公开的疫苗还可含有外源核酸分子，其在体内表达合适的细胞因子，例如与待接种的或将在其中引发免疫反应的宿主匹配的细胞因子例如，对于待向牛施用的组合物而言牛细胞因子。[0158]在一个具体实施方案中，佐剂可包括TS6、TS7、TS8和TS9乳液美国专利号7,371，395;LR3和LR4US7,691,368;TSAP美国公开专利申请20110129494;TRIGEN™NewportLabs;合成dsRNA例如poly-IC、poly-ICLC[HILT0N0L®];CARBIGEN™佐剂（MVPLaboratories,Inc·;ENABL®佐剂（VaxLiant和M0NTANIDE™佐剂（W0、W0W、0W、頂S和凝胶）（SEPPIC。最终的免疫组合物或疫苗组合物中的佐剂浓度范围可为5%至80%vv。[0159]在基于杆状病毒昆虫细胞表达的多肽的免疫组合物和或疫苗的情况下，剂量可包括，约Iyg至约2000yg，约50yg至约IOOOyg，和约IOOyg至约500yg的FMDV抗原、表位或免疫原。剂量可包括约IO2至约10'约IO3至约1〇18、约IO4至约1〇16、约IO5至约1〇12个VLP病毒样颗粒）。在基于表达FMDV抗原的病毒载体的免疫组合物和或疫苗的情况下，剂量可包括约IO3个病毒颗粒至约1〇15个病毒颗粒，约IO3个病毒颗粒至约1〇14个病毒颗粒，约IO3个病毒颗粒至约IO13个病毒颗粒，约IO3个病毒颗粒至约IO12个病毒颗粒。可以基于任何病毒滴定方法计算病毒颗粒，所述方法包括但不限于FFA病灶形成测定FocusFormingAssay或FFU病灶形成单位FocusFormingUnit、TCID5Q50%组织培养物感染剂量）、PFU噬斑形成单位和FAID5O50%荧光抗体感染剂量）。剂量体积可为约0.1至约IOml，约0.2至约5ml。[0160]现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。实施例[0161]使用J·Sambrook等（MolecularCloning:ALaboratoryManual，第4版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,2014描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。[0162]实施例1以重组人腺病毒5为载体的FMDV抗原的构建[0163]实施例1.2以重组人腺病毒5为载体的FMDV嵌合A24-A12抗原的构建[0164]使用在基因组的El、E3和E4区域中具有缺失的人腺病毒C血清型5Ad5载体腺病毒载体）（GV11骨架，参见美国专利8，323，663构建表达嵌合FMDV蛋白的重组FMDV疫苗。嵌合FMDV蛋白含有FMDV血清型A24的结构衣壳基因（A24P1和非结构基因A242A-部分2B、FMDV血清型A12的非结构部分3B基因和蛋白酶基因（部分3B-C3SEQIDN0:2。[0165]将编码FMDVA24P1-2A-部分2B-A12部分3B-3C的嵌合多核苷酸引入穿梭质粒中渗见图2和3。在将线性化的GVll骨架质粒其携带卡那霉素抗性基因）和含有嵌合FMDV多核苷酸的线性化穿梭质粒共转化到BJDE3大肠杆菌细胞中后，选择大肠杆菌的卡那霉素抗性克隆。携带重组质粒的克隆通过RFLP确认。选择单个克隆，将质粒线性化并转染到M2A细胞中。将来自M2A细胞转染的裂解物连续传代以产生以重组腺病毒为载体的嵌合FMDV疫苗的高滴度原液。[0166]供体基因插入位点位于CMV启动子与Ad5El表达盒的SV40PolyA之间，将表达盒插入到El区域的BBA中。位于E1区域缺失连接处的A24-A12表达盒相对于病毒基因组RNA转录而言从右至左阅读。在插入盒的侧翼核苷酸序列中没有已知的调控信号。CMV增强子启动子控制转录的起始。在该序列内的是病毒增强子CAAT盒、TATA盒、转录起始位点和5’剪接位点序列。[0167]CMV序列之后是含有剪接供体序列的人工非翻译区UTR。待表达基因的开放阅读框遵循3’剪接位点序列，并且猿猴病毒40SV40早期多聚腺苷酸化信号位于开放阅读框的3’以终止转录。[0168]针对RBA遗传结构同一性GeneticStructuralIdentityGSI测定设计引物对。GSI测定使用PCR来鉴定骨架生物成分和表达盒。GSI印迹参见图4显示正确的骨架和A24-A12FMDV表达盒。A24-A12表达盒的序列分析也证实了穿梭质粒与从以重组腺病毒为载体的嵌合A24-A12FMDV疫苗中提取的DNA之间的核苷酸序列同一性。[0169]通过免疫印迹测定证实了以重组腺病毒为载体的嵌合A24-A12FMDV疫苗在293细胞中体外表达A24蛋白，产生了迀移至约28KDa位置的反应蛋白（参见图5。用于在免疫印迹测定中检测的抗体是单克隆抗体。从以重组腺病毒为载体的嵌合A24-A12FMDV疫苗表达的A24蛋白的分子量与将阳性对照穿梭质粒转染入293细胞后观察到的分子量无差别（参见图5〇[0170]实施例1.2以重组人腺病毒5为载体的FMDVOlM抗原的构建[0171]使用在基因组的El、E3和E4区域中具有缺失的人腺病毒C血清型5Ad5载体腺病毒载体）（GV11骨架，参见美国专利8，323，663构建表达FMDV蛋白的重组FMDV疫苗。FMDV蛋白含有结构衣壳PlVP4-VP2-VP3-VP1和非结构蛋白2ABC和3ABC，包括来自FMDV01Man87毒株的全长蛋白酶3CSEQIDN0:4。[0172]将编码FMDVOlMPlVP4-VP2-VP3-VP卜2ABC’3A’BC的合成多核苷酸（SEQIDN0:3引入穿梭质粒中（参见图6。按照实施例I.2中描述的方法构建以重组腺病毒为载体的OlMFMDV疫苗。[0173]位于El区域缺失连接处的01M87FMDV表达盒相对于病毒基因组RNA转录而言从右至左阅读。在插入盒的侧翼核苷酸序列中没有已知的调控信号。CMV增强子启动子控制转录的起始。在该序列内是病毒增强子CAAT盒、TATA盒、转录起始位点和5’剪接位点序列。[0174]CMV序列之后是含有剪接供体序列的人工非翻译区UTR。待表达的基因的开放阅读框遵循3’剪接位点序列，并且猿猴病毒40SV40早期多聚腺苷酸化信号位于开放阅读框的3’以终止转录。[0175]GSI印迹显示正确的骨架和01M87FMDV表达盒。01M87FMDV表达盒的序列分析还证实了穿梭质粒与从以重组腺病毒为载体的01M87FMDV疫苗中提取的DNA之间的核苷酸序列同一性。通过免疫印迹测定证实了以重组腺病毒为载体的01M87FMDV疫苗在293细胞中体外表达01M87蛋白。[0176]实施例1.3构建以重组人腺病毒5为载体的FMDVIrn抗原[0177]使用在基因组的El、E3和E4区域中具有缺失的人腺病毒C血清型5Ad5载体腺病毒载体）（GV11骨架，参见美国专利8，323，663来构建表达FMDV蛋白的重组FMDV疫苗。将Pl的合成FMDV衣壳编码序列和非结构基因2A、2B、部分2C2C’）、部分3A3A’）、3B以及FMDV血清型AIrn05的3C蛋白酶编码序列引入穿梭质粒中（参见图7。按照实施例1.2中所述的方法构建以重组腺病毒为载体的IrnFMDV疫苗。[0178]位于El区域缺失连接处的IrnFMDV表达盒相对于病毒基因组RNA转录而言从右向左阅读。在插入盒的侧翼核苷酸序列中没有已知的调控信号。CMV增强子启动子控制转录的起始。在该序列内的是病毒增强子CAAT盒、TATA盒、转录起始位点和5’剪接位点序列。[0179]CMV序列之后是含有剪接供体序列的人工非翻译区UTR。待表达基因的开放阅读框遵循3’剪接位点序列，并且猿猴病毒40SV40早期多聚腺苷酸化信号位于开放阅读框的3’以终止转录。[0180]使用基于PCR的遗传结构同一性（GSI测定法鉴定以重组腺病毒为载体的IrnFMDV疫苗，并通过免疫印迹技术使用蛋白质表达进行确认。[0181]实施例1.4构建以重组人腺病毒5为载体的FMDVAsia抗原[0182]使用在基因组的El，E3和E4区域中具有缺失的人腺病毒C血清型5Ad5载体腺病毒载体）（GV11骨架，参见美国专利8，323，663来构建表达FMDV蛋白的重组FMDV疫苗。将Pl的合成的FMDV衣壳编码序列和非结构基因2A、2B、部分2C2C’）、部分3A3A’）、3B以及来自FMDV株AsiaLeb89的3C的蛋白酶编码序列引入穿梭质粒中（见图8。按照实施例1.2中所述的方法构建以重组腺病毒为载体的AsiaFMDV疫苗。[0183]位于El区域缺失连接处的AsiaFMDV表达盒相对于病毒基因组RNA转录而言从右至左阅读。在插入盒的侧翼核苷酸序列中没有已知的调控信号。CMV增强子启动子控制转录的起始。在该序列内的是病毒增强子CAAT盒、TATA盒、转录起始位点和5’剪接位点序列。[0184]CMV序列之后是含有剪接供体序列的人工非翻译区UTR。待表达的基因的开放阅读框在3’剪接位点序列之后，并且猿猴病毒40SV40早期多聚腺苷酸化信号位于开放阅读框的3’以终止转录。[0185]通过免疫印迹测定证实了以重组腺病毒为载体的AsiaFMDV疫苗在293细胞中体外表达Asia蛋白，产生迀移至约38kDa位置的反应蛋白。用于在免疫印迹测定中检测的抗体是FMDVP2多克隆抗体。表达的AsiaSS.2B蛋白的分子量与将阳性对照质粒转染到293细胞后观察到的分子量无区别。[0186]实施例2牛和猪中进行的攻击研究[0187]在第0天通过IM用A24-A12FMDV疫苗或01M87FMDV疫苗接种牛和猪一次，并在第14天用许多FMDV血清型诸如△24^12、01^8丨、1«1和1抑9株进行攻击。[0188]图9显示了在三种不同剂量和对照下OlFMDV疫苗在动物中抗FMDV攻击的保护作用。在该剂量滴定研究中，评估了以重组腺病毒为载体的OlMFMDV疫苗在接种后14天dpv进行直接IDL同源攻击后赋予抗FMD全身性疾病足部病变pedallesions的保护作用的能力。将健康的6个月大的雌性Holstein牛随机分配到四个治疗组之一。用单个2mL剂量的最终制剂缓冲液FFB肌内免疫对照，即首次接触实验的牛T01;n=4。用递减剂量[抗腺病毒六邻体病灶形成单位FFU或病灶形成测定FFA;l0g1Q]的从在ENABLtmCI佐剂中配制的主种病毒第2代MSV+2制备的活性成分接种T02-T04n=7组）中的牛。T02-T04分别接受2.381105、5.94110午?1]或1.49110午?1]总剂量。在疫苗接种后2周攻击当天），100%的1'02和T03接种物具有FMDVOlManisa血清病毒中和SVN滴度，而最低疫苗剂量治疗组T04中为43%。在用lxIO4牛感染剂量单位50%BID5q的FMDV01Manisa进行皮内舌攻击后，100%的TO1对照首次接触实验的牛表现出全身性疾病足部病变）。相反，接种组中抗全身性疾病的保护水平范围为86%T04至100%T02和T03。在攻击后1-3天dpc采集的血浆中，所有四只对照牛TOl均为FMDV阳性，而21份接种中没有一份在l-5dpc时具有可检测的血浆病毒血症。在TOl中，88%的在2-5dpc采集的鼻样品为病毒阳性，相比之下，2-5dpc测试样品的病毒阳性为25%T03、27%T02和36%T04。图10显示三种剂量的OlFMDV疫苗和对照的血清学。[0189]这些结果表明，在ENABLCl佐剂中配制的以重组腺病毒为载体的OlMFMDV疫苗活性成分具有高免疫原性并且在牛中有效地抗IDL、同源FMDV攻击，并提供了关于估计的最小保护剂量的数据。[0190]A24-A12和01M87疫苗经测试在小牛和小鼠中均是安全的。[0191]实施例3佐剂血清学免疫原性和相应的杀病毒稳定性研究[0192]对疫苗加以佐剂可以降低最小保护剂量MPD并产生更有效的疫苗。降低的MPD可通过佐剂成本和供应安全性来平衡。然而，一些佐剂可降低疫苗效力。佐剂可以将免疫系统推向不希望的反应，或者佐剂可能对免疫剂有害例如缺乏稳定性）。[0193]本研究的目的是评估佐剂血清学功效。在牛中进行功效血清学研究，并且同时进行杀病毒稳定性研究，以确定五种佐剂中的任何一种是否对腺病毒FMDV疫苗具有不利影响。每剂量由200μ1最终AI活性成分剂量（以2ml剂量）和每种佐剂组成。佐剂是聚丙烯酸、LF2乳液、LR6乳液、CarbigentmM和ENABLeCi渗见下表1.1。[0194]表1.1腺病毒FMDV疫苗的制备[0195][0196]TS6*:如US7,608,279和US7,371,395中所述的TS6佐剂乳液[0197]LR4#:如US7,691，368中所述的LR4佐剂乳液[0198]CARBIGEN™:基于卡波姆Carbopol934P的佐剂悬浮液，MVPLaboratories,Inc的广品。[0199]ENABIC1:从VaxLiant商购的牛的佐剂产品[0200]表1.2TS6乳液US7,608,279和US7,371，395中描述的预乳液口代11111181〇11[0201][0202]表1.3LR4乳液US7,691，368中描述的预乳液）[0203][0204]将疫苗在4°C和25°C下储存并随时间进行测试。根据标准病灶形成测定滴定测定法滴定每种疫苗中的病毒，其中通过细胞单层上的特异性抗腺病毒抗体读取检测到的病毒量。比较各自的滴度。前3个月的数据示于下表2以及图1125°C和124°C中。在4°C时，存在于配制疫苗中的大多数抗原或病毒在达3个月内是稳定的。在25°C下，用佐剂聚丙烯酸、LF2和CarbigenM配制的抗原或病毒在7周内相对稳定。这三种制剂的稳定性在25°C下在3个月时略有下降。然而，当将重组病毒与佐剂组合时该下降较少，从而证实了佐剂的保护作用。用佐剂LR6配制的抗原或病毒经历了一些佐剂测定干扰，如在4°C和25°C下的以下检测水平所证明的。然而，用LR6佐剂化的制剂在3个月时产生特定的病毒滴度并且在25°C下是稳定的。[0205]表2五种佐剂长达3个月的杀菌和稳定性研究[0206][0207]低于检测*:佐剂测定干扰[0208]在牛中进行相应的血清学研究。每组包含10只动物实验组对照组5只），并在第0天施用一次2ml剂量，然后在第21天给予加强。在整个研究中的几个时间点采集血液样品并分析血清样品。进行通过病毒中和滴度的血清学检测。初始数据指示在第一次疫苗接种后第14天几个组中的血清学反应。总之，数据表明，在某些佐剂中配制的以腺病毒为载体的FMD疫苗可提供改善热稳定性的机会和处理温度偏移的能力。当与这些初始数据组合时，免疫反应得以维持或可能得到改善。[0209]实施例4用多种以重组人腺病毒为载体的FMDVOlM抗原在牛中进行两剂疫苗接种的血清学免疫原性[0210]本研究的目的是评估在使用和不使用不同佐剂配制的以Adeno为载体的FMDV0IManisa施用后牛中的血清学抗体反应。[0211]将55只常规饲养的小牛（约5个月大各自随机分配到6个治疗组之一，如下表4所不。[0212]表4[0213][0214]除来自组6标记（sentinels的那些小牛外，所有小牛用具有组1-4或不具有组5佐剂的以腺病毒为载体的ΟΙManisa构建体进行接种，以21天的间隔用2ml测试疫苗接种2次。通过肌内途径（頂交替地在右侧和左侧肩膀上给予所有注射。上表4包含每组的治疗概述。[0215]在每次接种后间歇地观察所有小牛的急性全身性不良事件的临床体征至少1小时。在第-1天接种前）、第7天、第15天、第21天接种前）、第28天和第35天从所有牛采集血液样品。通过血清病毒中和SVN测试来自所有牛的血清样品的FMDV抗体。另外，在第-1天和第35天采集的样品中，测定了来自所有组的所有动物的对腺病毒SAV的抗体反应。VSN和SAV的结果以Log1Q报告，0.9。[0220]到第14天第1次接种后2周），ENABL®C1组1中的510小牛（50%已发生血清转化。剩余的接种组2-5中的那些小牛具有20-40%的小牛血清转化。另外，每组的平均抗体滴度在组IEMB:L®C1中略高，其次是组2LF和组3聚丙烯酸）（图13。[0221]到第35天（第二次接种疫苗后2周），所有接种疫苗的动物（组1[ENABL®]、组2[LF]和组5[无佐剂]均已发生血清转化，其次为组3聚丙烯酸和组4CarbigenM中分别有90%和80%的小牛发生血清转化。[0222]用LF佐剂接种的动物，其次是用不含佐剂的疫苗接种的动物（组5，以及其次用ENABL®C1组1佐剂接种的动物在双剂疫苗接种方案后具有较高的抗体反应（参见图13〇[0223]下面描述根据血清病毒中和SVNL〇g1Q，使用腺病毒抗体获得的FMDV血清学反应的结果。[0224]所有标记和接种疫苗的小牛根据第-1天的SN抗体滴度（彡0.6Log1Q对腺病毒呈阴性。在第35天，除了一只接种过的小牛（ID:134;组5之外的所有小牛发生血清转化，其中在用含有佐剂的疫苗接种的那些组组1-4中具有总体更高的几何平均滴度参见图14。[0225]结果表明了在第一次接种疫苗后第14天时几个组的血清学反应。在第二次接种疫苗后两周，在用LF佐剂接种疫苗的小牛中观察到较高的抗体反应，其次是用不含佐剂的疫苗接种的小牛和用EnabIeCl佐剂疫苗接种的小牛。[0226]结果表明，无论佐剂存在与否，单次接种疫苗后的抗体反应都很小。然而，通过使用两次疫苗接种初免-加强方案，抗体反应总体上更高。当肌内施用疫苗构建体两次（间隔3周时，没有观察到全身性不良事件。[0227]实施例5在猪中接种疫苗后FMDV疫苗的血清学评估[0228]本研究的目的是在施用含有以Adeno5为载体的FMDVOlManisa和或FMDV杆状病毒表达的OlManisa重组病毒样颗粒VLP的单价疫苗制剂后评估仔猪中的抗体反应。[0229]将20只常规饲养的仔猪约5周龄随机分成两个处理组，每组包含10只仔猪。各组的组成如下表5中所示。[0230]表5[0231][0232]组1中的仔猪用2ml的疫苗接种。通过肌内途径（頂交替地在右侧和左侧肩膀上给予所有注射。在每次接种疫苗之前观察仔猪的整体健康状况。在第〇天接种疫苗前）、第7天、第14天、第21天接种疫苗前）、第28天和第35天从所有仔猪采集血液样品。通过血清病毒中和SVN测试来自所有仔猪的第35天血清样品的FMDV抗体。来自组1的那些仔猪的样品在所有采集日进行SVN测定，因为它们在第35天后具有总体更高的抗体反应。结果以Log10报告，并且值〇.75L〇g1Q被认为是血清抗体阴性的。疫苗接种后安全性评估包括每次接种后进行3天的直肠温度、目视检查和注射部位触诊。[0233]下面描述根据血清病毒中和（SVNL〇g1Q，使用FMDV抗体获得的FMDV血清学反应的结果。[0234]在研究之前和研究结束时，所有标记对FMDV抗体均呈阴性。[0235]到第28天（第二次疫苗接种后1周），来自组1的所有仔猪发生血清转化（滴度多1.201〇g1Q参见图15。没有观察到可归因于疫苗接种的全身性和或局部不良事件。结果清楚地表明，即使接种组在第一次疫苗接种后具有小的抗体反应，第二次初免-加强接种后的抗体反应在研究结束时也很高。[0236]实施例6施用途径[0237]本研究的目的是评估当使用两种以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗一种以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗和一种杆状病毒表达的重组FMDV病毒样颗粒VLP疫苗或使用两种FMDVVLP疫苗时和当使用不同的施用途径透皮、皮下或皮内施用途径时，双剂量疫苗接种在牛或猪中的的血清学反应。本研究还旨在解决施用多种疫苗时的干扰问题。[0238]佐剂是聚丙烯酸、LF2乳液、LR6乳液、CarbigentmM和ENABLeCI。治疗组示于下表6中。[0239]表6[0240][0241]在每次疫苗接种后间歇地观察小牛的急性全身不良事件的临床体征至少1小时。在第-1天接种疫苗之前）、第7天、第15天、第21天疫苗接种之前）、第28天和第35天从所有牛采集血液样品。通过血清病毒中和SVN测试来自所有牛的血清样品的FMDV抗体。另外，在第-1天和第35天采集的样品中，测定来自所有组的所有动物中的对腺病毒SAV的抗体反应。[0242]疫苗接种后安全性评估包括每次疫苗接种后持续至少3天的直肠温度、目视检查和注射部位触诊。间歇地观察具有局部注射部位不良事件的母牛直至异常消退。[0243]结果显示所有组的初免-增强效应，但在接受腺病毒疫苗初免，随后接受杆状病毒-FMD构建体加强的动物中初免-加强效应更大。此外，施用途径对血清学反应和保护作用以及免疫持续时间有影响。特定的施用途径和或施用途径TD、頂和SQ的特定组合似乎加剧了免疫反应，进一步增强保护作用，克服干扰，以及保护母源性抗体阳性MaternallyDerivedAntibody-positiveMDA阳性动物。[0244]实施例7在猪中的功效[0245]在初免-加强方案中以21天的间隔使猪接种FMDV疫苗针对几种血清型）两次，该方案考察异源初免-加强方案腺病毒初免，然后杆状病毒加强）以及同源初免-加强腺病毒-腺病毒;杆状病毒-杆状病毒），并在14dpv利用许多FMDV血清型诸如A24、Al2、Ol、Asia、Irn和Iraq株进行攻击。[0246]在剂量滴定研究中，评估以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗在疫苗接种后14天dpv时进行同源和异源攻击后，赋予抗FMD全身性疾病足部病变）的保护作用的能力。在本研究中使用实施例2中描述的方法来确定初免-加强施用方案中的最小保护剂量。[0247]结果表明，初免-加强方案中使用的重组腺病毒FMDV疫苗在猪中具有高度免疫原性，并且可在猪中有效抵抗同源和异源FMDV攻击，克服干扰并保护母源性抗体阳性MDA阳性动物。[0248]实施例8在牛中的功效[0249]首先用以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗接种牛，然后以21天的间隔用常规的灭活FMD疫苗或杆状病毒表达的FMDVVLP疫苗进行加强，并在第二次疫苗接种后第14天利用许多FMDV血清型诸如△24^12、01^8丨、1«1和1抑9株进行攻击。[0250]在剂量滴定研究中，评估以重组腺病毒为载体的FMDV疫苗在接种后14天dpv进行直接同源和异源攻击后赋予抗FMD全身性疾病足部病变）的保护作用的能力。在本研究中使用实施例2中描述的方法来确定初免-加强施用方案中的最小保护剂量。[0251]结果表明，初免-加强施用方案在牛中具有高度免疫原性并有效地抵抗同源和异源FMDV攻击，并且在动物中提供抵抗FMDV感染的保护作用，克服干扰并保护母源性抗体阳性MDA阳性动物。[0252]氺氺氺[0253]在已经如此详细地描述了本公开的实施方案后，应当理解，由以上述实施例限定的本公开不限于在以上描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本公开的精神或范围的情况下可以进行其的许多明显变化。[0254]本文中引用或参考的所有文献（“本文中引用的文献”），以及本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，与本文中或本文中通过引用并入的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品说明书在此通过引用并入本文，并且可用于本发明的实施中。

权利要求：1.一种包含表达口蹄疫病毒FMDV抗原的重组病毒载体的组合物或疫苗。2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述病毒载体是腺病毒。3.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中所述抗原包含结构FMDV蛋白和非结构FMDV蛋白。4.权利要求3的组合物或疫苗，其中所述FMDV抗原包含具有SEQIDN0:2、4、6或8所示的序列的多肽。5.权利要求1-4中任一项的组合物或疫苗，其中所述FMDV抗原由具有SEQIDNO:1、3、5或7所示的序列的多核苷酸编码。6.权利要求1-5中任一项的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗还包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。7.权利要求1-6中任一项的组合物或疫苗，其中组合物或疫苗具有改善的热稳定性和处理温度偏移的能力。8.权利要求1-7中任一项的组合物或疫苗，其中所述药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物选自聚丙烯酸、LF2乳液、LR6乳液、TS6乳液、LR4乳液、卡波姆、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、CpG、油包水乳液、水包油乳液、carbigen™*9.一种对易受FMDV感染的动物进行疫苗接种或在动物中引发针对FMDV的免疫反应的方法，其包括至少一次施用权利要求1-8的任一项的组合物。10.权利要求9的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。11.权利要求10的方法，其中所述初免-加强方案包括初次施用根据权利要求1的组合物，和加强施用包含含有用于体内表达FMDV抗原的多核苷酸的重组病毒载体的组合物、包含FMDV抗原的组合物或包含FMDV抗原的灭活病毒组合物，以保护所述动物免于FMDV感染和或预防感染动物的疾病进展。12.权利要求10的方法，其中所述初免-加强方案包括初次施用包含含有用于体内表达FMDV抗原的多核苷酸的重组病毒载体的组合物，或包含FMDV抗原的组合物或包含FMDV抗原的灭活病毒组合物，和加强施用根据权利要求1的组合物，以保护动物免于FMDV感染和或预防感染动物的疾病进展。13.权利要求9-12中任一项的方法，其中所述方法保护母源性抗体阳性MDA阳性动物免于FMDV感染。

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