申请/专利权人：湖北武汉青鱼原种场

申请日：2019-06-26

公开（公告）日：2023-03-17

公开（公告）号：CN110205392B

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.03.17#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.06#公开

摘要：本发明属于鱼类技术领域，具体公开了青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用。本发明筛选并合成6对青鱼荧光标记微卫星引物，该引物可用于建立青鱼亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定试剂盒。本发明首次在青鱼上建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了100%。通过家系的筛选和鉴定，可以减少在青鱼群体选育中存在的近亲繁殖现象，更有利于实现家系选育，从而加快选育的进程，提高选育效果。

主权项：1.青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用，所述的引物组如下：Mpi-142F:5’-ACGCTGACCTTCCGTTTATG-3’；R:5’-CATGACTCGCTGAAACATGA-3’；Mpi-239F:5’-GGATGAGTTCTCCCAGAGACA-3’；R:5’-GCACCACTGCTAAAAACAAACA-3’；Mpi-255F:5’-TTACCCTGGTACATGTTGTGC-3’；R:5’-GCAAGTCAAACCAATCAATC-3’；Mpi-260F:5’-CATTGATGGTTCCACGATGA-3’；R:5’-CAAACCTTGGAACTTGCACA-3’；Mpi-376F:5’-TTTCCTGAGGGCAAGAACAC-3’；R:5’-GACCTTTCCCTTTGCTACCC-3’；Mpi-519F:5’-CCTTCCAGCTCTATCTGTCTG-3’；R:5’-ACCGAAGGACTGCAGAGTGT-3’。

全文数据：青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用技术领域本发明涉及鱼类分子标记辅助选择领域，具体涉及青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用。背景技术青鱼Mylopharyngodonpiceus隶属硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，青鱼属，主要分布于我国长江以南的平原地区，长江以北较稀少；它是长江中、下游和沿江湖泊里的重要渔业资源和各湖泊、池塘中的主要养殖对象，为我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，也是“四大家鱼”中生长最快的鱼类。其食性广、成本低、生长快、成活率高、易捕捞，能在池塘中产卵繁殖，繁殖，且消费市场需求极大，因此被作为优良的杂食性鱼类品种在全国范围内普遍推广。近年来，青鱼消费市场的畅销品种，养殖经济效益较好，因而市场对青鱼优良苗种的需求十分迫切。但由于青鱼苗种生产中普遍存在近亲繁殖的现象，导致种质退化加剧，常规苗种的生长速度较慢，不仅影响了青鱼的生长性能，而且在定程度上制约了青鱼在更大范围的推广。在鱼类遗传育种中，准确的系谱记录对于育种计划的制定具有关键性作用。由于鱼类所处的环境特点以及繁有过程中自然交配、混合受精等原因，常常造成个体系谱不明确。对于鱼类来说，为了保持家系信息，对不同的家系实施分池养殖存在所需水体大、管理强度人的缺陷，同时，大大限制了家系的数目，不利于得出正确的估计值，更重要的是，不同的环境因素影响了不同家系的性状，使有种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于有种计划的制定:在混合养殖群体中保持家系信息，在鱼类上应用的传统的物理标记方法有剪鲭、烙印、体外标编码金属标、被动整合雷达标、荧光染料、电子芯片等。其中一些标记在家育上应用较广泛也有良好的效果，如电子芯片。但是对水产动物尤其是鱼类来说，由于其所处的水体环境及值体自身的特点，使用物理标记存在操作繁琐、易损伤鱼体、对生长造成一定影响、标记保存时间不长等缺陷。而且，物理标记不适用于仔鱼或幼鱼，因此，在育种时首先需要对各家系分池养殖，待到可以进行物理标记时才能实施混养。这样不仅增加了养殖成本，更重要的是引入了环境误差。因此，对于鱼类个体标识、家系鉴定直是难以解决的问题，这在很大程度上限制了良种选自工作的开展。微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点，为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。如果已知父母的基因型，微卫星标记能在没有外部物理标记且不需要分开养殖的情况下区分出混养群体中个体所属的家系。有关研究革世瑞等2008；Wangetal.2009；Luoetal.2014；Luoetal.2017证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系中的应用价值。目前尚末见将微卫星标记应用于青鱼家系鉴定的报道。发明内容本发明的目的在于提供青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用，为青鱼遗传育种提供了必要的分子标记，为实施青鱼家系育种规划提供理论依据。为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用，包括利用本领域的常规方式，利用本发明提供的引物组对青鱼进行亲子鉴定；或是利用该引物组制备成青鱼亲子鉴定试剂盒。所述的引物组如下：Mpi-142F:ACGCTGACCTTCCGTTTATG5’-3’R:CATGACTCGCTGAAACATGA5’-3’Mpi-239F:GGATGAGTTCTCCCAGAGACA5’-3’R:GCACCACTGCTAAAAACAAACA5’-3’Mpi-255F:TTACCCTGGTACATGTTGTGC5’-3’R:GCAAGTCAAACCAATCAATC5’-3’Mpi-260F:CATTGATGGTTCCACGATGA5’-3’R:CAAACCTTGGAACTTGCACA5’-3’Mpi-376F:TTTCCTGAGGGCAAGAACAC5’-3’R:GACCTTTCCCTTTGCTACCC5’-3’Mpi-519F:CCTTCCAGCTCTATCTGTCTG5’-3’R:ACCGAAGGACTGCAGAGTGT5’-3’与现有技术相比，本发明具有以下优点：1.本发明可用于鉴定不同家系子代混养的种群，不需要将各家系子代采用水族箱或水泥池分开放养，可极大节省人力、物力和财力。2.本发明提供的引物对青鱼亲子鉴定的准确性达到了100％。3.本发明对正向引物进行了荧光标记，并基于6个微卫星位点PCR扩增产物的大小，将三种不同颜色FAM、ROX、HEX荧光引物扩增的PCR产物混合为一个基因型分析样品，极大的节省的基因型分析的费用。附图说明图1为Mpi-142Mpi-519Mpi-255三个微卫星位点PCR扩增产物在基因分析仪上所显示的基因型示意图；其中，标记1是Mpi-142位点PCR扩增产物峰图；2是Mpi-519位点PCR扩增产物，3是Mpi-255位点PCR扩增产物；4是荧光标记的标准片段GeneScanTM500LIZTMSizeStandard。图2为Mpi-239Mpi-260Mpi-376三个微卫星位点PCR扩增产物在基因分析仪上所显示的基因型示意图；其中，标记1是Mpi-239位点PCR扩增产物，2是Mpi-376位点PCR扩增产物，3是Mpi-260位点PCR扩增产物；4是荧光标记的标准片段GeneScanTM500LIZTMSizeStandard。具体实施方式以下为本发明的具体实施方案。实施中所涉及到的仪器、试剂均为购买商品。以下列出一些主要设备及试剂来源：1.主要仪器1MilliporeQSynthesis超纯水系统2日本三洋SIM-F140制冰机3日本三洋MU53V519L超-80℃低温冰箱4微量移液器Eppendorf5QiagenTissueLyserII核酸提取样品处理系统6ThermoScientificCL31Multispeed离心机7Bio-RadDNAEnginepeltierThermalCyclePCR仪8NanoDropND-2000紫外分光光度仪9AlphaInnotech公司的AlphamagerEP凝胶成像系统10ABI3730基因分析仪2.主要试剂TaqDNA聚合酶，Buffer含Mg2+，dNTPs，购自中国天根生化科技有限公司；各微卫星位点正向荧光标记引物由美国ABI公司合成，GeneScanTM500LIZTMSizeStandard购自美国ABI公司；其它普通化学试剂和分析纯均购自上海生工生物工程有限公司和天根生化科技有限公司。实施例1：青鱼亲子鉴定微卫星标记的筛选：从武汉青鱼场亲鱼群体中挑选了5条优良父本和4条母本，提取DNA后进行多态性SSR标记的筛选；从已发表的青鱼微卫星位点中选取位点进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL：2xEsTaqMasterMixDye5μL、ddH2O4μL、正反引物各0.25μL、模板DNA0.5μL。热循环参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃保存5min，降温至10℃保存。PCR扩增后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析青鱼亲本的基因型，最终筛选出在亲本中具有高多态性的微卫星位点6个MP142，MP239，MP255，MP260，MP376，MP519，如表1所示。表1筛选的6对青鱼微卫星位点信息实施例2：实施例1筛选得到的分子标记引物可用于青鱼亲子鉴定的验证：1按照常规方案提取青鱼的DNA采集青鱼候选亲本尾鳍样本9条其中包含真实亲本2尾，编号为MP-1，MP-2，子代22尾均为MP-1，MP-2的子代，无水酒精保存备用。取青鱼亲本个体的一小块鳍条组织放入1.5mL的Eppendorf离心管中，加入600μL的细胞裂解液Tris-HCL100mM，pH8.0；EDTA50mM，pH8.0；SDS1％，pH8.0；NaCl125Mm，用剪刀将鳍条组织剪碎，加入浓度为20mgmL的蛋白酶K6μL，放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解完。在常温下静置离心管直到其温度降到室温，加入200μL7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放入4℃冰箱内10min，12000rpm4℃离心10min，.取上清液，重复离心一次，取上清液到另一新离心管中。加入与上清液等量的异丙醇，充分混匀，室温下沉淀2min，12000rpm4℃离心10min，弃去上清液，先用70％的酒精洗涤DNA一遍，再用100％的酒精将DNA洗涤一遍，室温干燥约10min，加入50μL去离子水溶解DNA。隔夜后用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量，再将合格的DNA样品进行琼脂糖电泳检测，最后将各合格DNA样品稀释成100ngμL的工作液。2亲子鉴定体系的建立以22尾家系个体为子代群体编号为1-35，假设9个候选亲本MP-1，MP-2，MP-3，MP-4，MP-5，MP-6，MP-7，MP-8，MP-9，其中MP-1，MP-2为真实亲本，其余为非亲本均为这22个子代个体的亲本，用筛选出的6个青鱼微卫星标记进行模拟亲子鉴定，抽样10000次。3亲子鉴定分析合成表1所示的6对青鱼微卫星引物，按照表1所示的荧光标记对每对引物的正向引物5’端进行荧光标记。按照以下体系进行PCR扩增：PCR反应体系为20μL，包括2×EsTaqMasterMixDye10μL、ddH2O8μL、正反引物各1.5pmol、模板DNA100ng。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃保存5min，降温至10℃保存。PCR反应完后，根据荧光强度，将三种不同颜色的荧光引物的PCR产物按照FAM：ROX：HEX17μL：17μL：17μL的比例混合在一起作为上机检测样品，其中Q142、Q519和Q255三个位点组合为一个基因型分析上机样品，Q239、A260和Q376三个位点组合为一个基因型分析上机样品。从混合样品中吸取3.5μL的PCR产物样品加入到ABI3730基因分析仪配置的96孔板内，每个孔内加入0.5μLABI公司生产的GeneScanTM500LIZTMSizeStandard一种荧光标记的标准片段，另外在每个孔内加入6.0μL的Hi-DiTM甲酰胺ABI，将96孔板放入PCR仪器内95℃变性10分钟，变形后立即置于冰上，然后上样到ABI3730基因分析仪分析，或者用铝箔纸包好后放入-20℃保存待上机分析。待基因分析仪电泳结束后，用软件GeneMarker做基因型分析，读取各个体在各微卫星位点的基因型，如图1和2所示MP-1获得的基因型图。采用Cervus3.0软件开展等位基因频率、系谱模拟分析以及真实系谱分析，获得各微卫星位点扩增的等位基因数Na、期望杂合度He、为多态信息含量PIC、排除概率PE以及累计排除概率CPE等，如表2所示。表26个微卫星标记等位基因数Na、期望杂合度He、为多态信息含量PIC、排除概率PE以及累计排除概率CPE分析结果显示，6个微卫星位点单亲累计排除率为0.997，6个位点父权累计排除率为0.999,6个位点双亲累计排除概率为1.000。22个子代个体均准确找到亲本，鉴定结果如表3所示。表322个子代个体亲子鉴定的结果22个青鱼子代个体亲子鉴定结果如表3所示，其中LOD值为亲子关系的对数值，LOD值大于0表示与其他候选亲本相比，MP-1最有可能是真实到亲代。上述结果表明22个个体均准确的找到了真正到亲本MP-1。进一步分析结果也证实22个个体也均准确的找到了真正的亲本MP-2。非亲本MP-3～MP-9的LOD值均小于0。以上分析结果证实这6个青鱼的微卫星标记用于青鱼亲子鉴定是可行的。实施例3：青鱼亲子鉴定的SSR荧光标记引物在青鱼亲子鉴定中的应用，包括如下步骤：选取实施例1的5条优良父本和4条母本，通过注射激素的方法进行人工催产。激素注射方法为：第一次注射，只注射雌鱼，注射黄体素释放激素A2LRH-A2，注射剂量为注射剂最为1mgkg体重；第二次注射约在第一次注射12h后进行，雌雄青鱼均注射，注射药物为促黄体素释放激素A2和地欧酮DOM，注射剂量分别为4mgkg体重和5mgkg体重。在第二次注射完6-8h后，进行人工授精，共繁殖获得了10个家系，记录各雌雄亲本交配方式。剪取繁殖亲本的臀鳍鳍条一小块，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。将各家系受精卵混合孵化，鱼苗孵出后放养在面积为10亩的池塘中。在池塘内喂养1个多月后，随机选取183尾子代，剪取青鱼小块臀鳍鳍条组织，储存在95％的酒精内，保存于-20℃。按照实施例2中的方法提取青鱼9尾亲本和183尾子代的基因组DNA。用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量，再将合格的DNA样品进行琼脂糖电泳检测，最后将各合格DNA样品稀释成120ngμL的工作液。按照实施例2中的方法对9尾亲本和183尾子代在6个微卫星位点进行PCR扩增。然后上样到ABI3730基因分析仪分析。待基因分析仪电泳结束后，用软件GeneMarker做基因型分析，读取各个体在各微卫星位点的基因型。基于步骤获得的各亲本与子代在6个微卫星位点的基因型，采用Cervus3.0软件进行子代的亲本来源分析，鉴定各个子代个体的相应父母本。基因型应用CERVUS3.0软件分析结果如表2所示。为保证鉴定结果准确，据LOD值鉴定候选父母时，只有所有微卫星专利座位全部匹配，并符合亲本交配体制的才确定亲子关系。最终确认了183尾个体的雌雄亲本来源，共来自8个家系，亲子鉴定率达到100％。实施例3：含有青鱼亲子鉴定的SSR荧光标记引物试剂盒，包括以下组成表3青鱼亲子鉴定试剂盒注：2×EsTaqMasterMix内包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和Taq酶。按上述剂量对试剂盒中的各组分分别进行包装，组成青鱼SSR亲子鉴定试剂盒。综上所述，本发明所建立的青鱼亲子鉴定技术和试剂盒能准确的用于青鱼亲子鉴定，为青鱼种质鉴定和遗传选育中家系的管理提供技术支撑，从而合理的指导青鱼选育过程中的人工繁殖工作。序列表湖北武汉青鱼原种场青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用12SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1acgctgaccttccgtttatg20220DNA人工序列ArtificialSequence2catgactcgctgaaacatga20321DNA人工序列ArtificialSequence3ggatgagttctcccagagaca21422DNA人工序列ArtificialSequence4gcaccactgctaaaaacaaaca22521DNA人工序列ArtificialSequence5ttaccctggtacatgttgtgc21620DNA人工序列ArtificialSequence6gcaagtcaaaccaatcaatc20720DNA人工序列ArtificialSequence7cattgatggttccacgatga20820DNA人工序列ArtificialSequence8caaaccttggaacttgcaca20920DNA人工序列ArtificialSequence9tttcctgagggcaagaacac201020DNA人工序列ArtificialSequence10gacctttccctttgctaccc201121DNA人工序列ArtificialSequence11ccttccagctctatctgtctg211220DNA人工序列ArtificialSequence12accgaaggactgcagagtgt20

权利要求：1.青鱼SSR标记引物组在青鱼亲子鉴定中的应用；所述的引物组如下：Mpi-142F:ACGCTGACCTTCCGTTTATG（5’-3’）R:CATGACTCGCTGAAACATGA（5’-3’）Mpi-239F:GGATGAGTTCTCCCAGAGACA（5’-3’）R:GCACCACTGCTAAAAACAAACA（5’-3’）Mpi-255F:TTACCCTGGTACATGTTGTGC（5’-3’）R:GCAAGTCAAACCAATCAATC（5’-3’）Mpi-260F:CATTGATGGTTCCACGATGA（5’-3’）R:CAAACCTTGGAACTTGCACA（5’-3’）Mpi-376F:TTTCCTGAGGGCAAGAACAC（5’-3’）R:GACCTTTCCCTTTGCTACCC（5’-3’）Mpi-519F:CCTTCCAGCTCTATCTGTCTG（5’-3’）R:ACCGAAGGACTGCAGAGTGT（5’-3’）。2.权利要求1所述的应用中的引物组在制备青鱼亲子鉴定试剂盒中的应用。

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