申请/专利权人：武汉戴安生物技术有限公司

申请日：2023-02-16

公开（公告）日：2023-06-02

公开（公告）号：CN116199792A

主分类号：C07K19/00

分类号：C07K19/00;C12N15/70;C12N15/90

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.06.20#实质审查的生效;2023.06.02#公开

摘要：本发明公开了一种基于SpyTag‑SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法，具体包括下列步骤：1表达载体的构建；2SpyCatcher‑AnnexinV、SpyTag‑GFP、SpyTag‑YFP、SpyTag‑RFP蛋白的诱导表达；3SpyCatcher‑AnnexinV、SpyTag‑GFP、SpyTag‑YFP、SpyTag‑RFP蛋白的层析纯化；4SpyCatcher‑AnnexinV分别与各个荧光蛋白的偶联。本发明属于生物工程技术领域，具体提供了一种基于SpyTag‑SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法。

主权项：1.基于SpyTag-SpyCatcher的AnnexinV偶联荧光蛋白的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：1表达载体SpyCatcher-AnnexinV、SpyTag-GFP、SpyTag-YFP、SpyTag-RFP的构建化学合成SpyCatcher-AnnexinV、SpyTag-GFP、SpyTag-YFP、SpyTag-RFP的基因序列，并通过同源重组的方法连接到表达载体pET28b上；2SpyCatcher-AnnexinV、SpyTag-GFP、SpyTag-YFP、SpyTag-RFP蛋白的诱导表达将表达载体转化RosettaBDE3感受态大肠杆菌，用卡那霉素和氯霉素双抗LB固体培养基37℃培养过夜筛选单菌落，即为原核表达工程菌，SpyCatcher-AnnexinV、SpyTag-GFP、SpyTag-YFP、SpyTag-RFP的原核表达工程菌分别如下：pET-SpyCatcher-AnnexinV-Rosetta-gamiBDE3，pET-SpyTag-GFP-Rosetta-gamiBDE3，pET-SpyTag-YFP-Rosetta-gamiBDE3，pET-SpyTag-RFP-Rosetta-gamiBDE3；挑取单菌落于20mL卡那霉素-氯霉素双抗LB液体培养基中37℃，220转分培养过夜，然后按照1：100的比例接种于1L含双抗的LB液体培养基中，37℃，220转分培养3～4h至OD600到0.4～0.6，然后将菌液置于冰水混合物中骤冷，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，取出50mL菌液作为诱导前的对照，16℃，120转分培养14h后3500g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用40mL的裂菌缓冲液重悬，60W超声破碎30min，超5s停5s，12000g离心10min收集上清；3SpyCatcher-AnnexinV、SpyTag-GFP、SpyTag-YFP、SpyTag-RFP蛋白的层析纯化将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍柱体积的层析溶液BufferW1洗涤，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.2mLmin，收集穿透FT，用于分析蛋白质与树脂的结合情况，层析用5倍NTA柱体积的层析溶液BufferW1洗涤，流速控制在0.5mLmin，分别用5倍柱体积的层析溶液BufferW1、BufferW2、BufferW3、ElutionBuffer洗涤和洗脱，流速控制在0.2mLmin左右，收集洗脱液，每管收集一个柱体积，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况，然后用SDS-PAGE胶分析每管蛋白质大致含量；4SpyCatcher-AnnexinV分别与SpyTag-GFP，SpyTag-YFP和SpyTag-YFP蛋白的偶联偶联具体条件如下：Buffer：25mMTris·HCl，150mMNaCl，pH8.5；温度：25℃；时间：16h。

全文数据：

权利要求：

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