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申请/专利权人：先正达生物科技(中国)有限公司;先正达农作物保护股份公司

摘要：本发明涉及植物组织培养和转化以及基因功能鉴定领域，特别地涉及向日葵列当Orobanchecumana抗性基因的鉴定。本发明建立了一种基于向日葵发根转化获得复合体而在体外条件下快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法。

主权项：1.一种快速鉴定向日葵列当抗性基因的方法，其包括以下步骤：1向日葵复合植物的获得：1.1种子消毒与萌发选择饱满的向日葵种子用于进行消毒；将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；1.2外植体分离选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；1.3侵染与共培养将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养，其中所述共培养进行2到3天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基；1.4筛选培养与根诱导培养共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物；2向日葵列当抗性鉴定：2.1向日葵列当种子的消毒和预培养对向日葵列当种子进行消毒；对向日葵列当种子进行预培养，其包括在培养皿底部放置灭菌的滤纸，用无菌水完全湿润滤纸，将经过消毒处理的向日葵列当种子尽量均匀地平铺在滤纸上一段时间，然后用于接种向日葵复合植物和野生型向日葵植物；2.2向日葵复合植物的处理选取具有健康生长点及具有至少3cm健壮发根的植物，小心地将复合植物从培养基中取出，用清水洗掉残留在根上的培养基，直接用于列当接种；2.3野生型对照向日葵种子的消毒和萌发挑选饱满的向日葵种子用于进行消毒，然后放在发芽纸中萌发7-10天后用于接种；2.4向日葵列当种子接种取方形培养皿，然后在底盖中填充混合好的基质，在基质上面覆盖灭菌的方形玻璃纤维滤纸，并用蒸馏水将玻璃纤维滤纸润湿；再将含有预培养的列当的滤纸片覆盖在玻璃纤维滤纸上；最后将向日葵或者向日葵复合植物的根放置在上面，地上部分朝向平皿开口一侧，将上盖盖上并用医用胶带将培养皿封好后放置在培养箱中培养，其中所述基质包括以1:1的蛭石和草炭的组合或者以1:1的蛭石和河沙的组合；2.5GFP表达检测和寄生瘤数量统计接种一段时间后，用肉眼观察和统计向日葵列当寄生瘤的数量，并在荧光显微镜下检查向日葵复合植物的发根以确认含有寄生瘤的发根均有GFP蛋白表达，其中所述向日葵复合植物包括转基因发根和非转基因地上部分。

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