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申请/专利权人：武汉中帜生物科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种基于RNA恒温扩增‑金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使淋病奈瑟菌核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

主权项：1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1扩增反应液：含40mMpH8.0的Tris-HCl，12mMMgCl2，70mMKCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，扩增中需要两对引物：淋病奈瑟菌扩增引物、内质控18S引物；1淋病奈瑟菌扩增引物：NG-R引物5’-3’：TAATCTGACTCACTAACGGGAGACTCAGACTGCGGACTGATCG；NG-F引物5’-3’：TTGGTCGACGTACAAACTAGC；2内参基因的扩增引物：内参-R引物5’-3’：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACAGTTATCCAAGTAGGAG；内参-F引物5’-3’：TCCTGCCAGTAGCATATGCT；2扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH；3核酸提取试剂：细胞裂解液；4检测液：包含金探针，为胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：1淋病奈瑟菌特异探针5’-3’：NG-CES1：TACGTCTTGAGAGGGAAttttGCTCGACTTGCCACCGAATA；NG-LES1：TCGGGCCAAGTGCAATCCttttGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT；NG-LES2：ATCAATGCCTACGATATTttttGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT；2内参特异探针5’-3’内参CES1：TTGGCTGAAGAATCCAACttttATCTGTATAGTGTCTGT；内参CES2：TTGACATGGAGCCTGCGGttttATCTGTATAGTGTCTGT；内参LES1：CTTAATTTGACTCAACACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；内参LES2：CCTAGAAGCACGTCGTTCGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG；内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；3C线显色探针5’-3’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；4金探针金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’5试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有质控线C线和两条检测线T线，从样品垫到吸水纸方向分别为NG-T、内参-T和C线；NG-T处包被NG包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列5’-3’为：NG包被探针：ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA；内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA。

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