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申请/专利权人：杨凌凯瑞生物科技有限公司

摘要：本发明公开了PCV2型衣壳蛋白基因cap、小分子佐剂flagellinTFlg与PCV2型衣壳融合蛋白基因Cap‑TFlg、表达菌株、表达方法、抗原制样及VLPs电镜观察；所述基因的核苷酸序列分别为SEQIDNO．1和SEQIDNO．2。所述基因在大肠杆菌中表达，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL‑21。本发明利用生物信息学手段，通过自主设计，对猪圆环病毒2型的ORF2和flagellinTFlg基因进行原核密码子优化，并人工合成适合在大肠杆菌高效表达的Cap和Cap‑TFlg蛋白表达基因。用本发明的Cap和Cap‑TFlgVLPs与适当的佐剂混合分别免疫仔猪，Cap‑TFlgVLPs能显著增强小猪的免疫应答，具有更好的免疫原性和保护性。

主权项：1.一种Cap-TFlg蛋白，其特征在于，编码所述Cap-TFlg蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.3；其中，通过在Cap蛋白C端展示TFlg提高PCV2VLPs疫苗免疫应答；编码所述Cap蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.1；所述的Cap-TFlg蛋白的制备方法为：将核苷酸序列为SEQIDNo.3转化进大肠杆菌进行原核表达制备得到；包括如下步骤：步骤一，Cap-TFlg基因人工合成，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，5’端带有NcoI酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点；步骤二：以pET-28α载体为骨架，使用NcoI和HindIII酶切并回收骨架片段，Cap-TFlg片段使用NcoI和HindIII酶切并回收，然后通过连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化入EZ10大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于10µL培养基中用于菌落PCR鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pBac-Cap3；步骤三，将预表达鉴定为阳性的菌种转接于200mlLB加抗生素的容量为1000ml的大锥形瓶中培养，转接比例是1:100，培养条件：37℃，200rpmmin培养3~4小时；步骤四：当OD600值达到0.4~0.6时，加乳糖至终浓度1%，开始诱导表达，诱导表达的条件：37℃，160rpmmin培养6小时；步骤五：用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；步骤六：加50ml缓冲液于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.9；步骤七：将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌，破菌条件：功率850w；破菌2分钟；步骤八：将破菌好的菌体离心，8000rpm，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀；步骤九：将沉淀物用50ml缓冲液重悬于50ml离心管中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.4；步骤十：分别取40μL上清和40μL重悬的沉淀，加10μL5×蛋白上样缓冲液，100℃加热10分钟，取10μL煮好的样品进行SDS-PAGE电泳检测，即得到所述的Cap-TFlg蛋白。

全文数据：一种通过C端展示TFIg提高PCV2VLPs疫苗免疫应答的方法[0001]技术领域：本发明属于兽用生物制药领域，具体涉及通过C端展示提高PCV2VLPs疫苗免疫应答的小分子佐剂flagelIinTFlg。背景技术[0002]猪圆环病毒2型Porcinecircovirustype2，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS的主要病原，此外还与猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、流产和渗出性皮炎等有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病。该病广泛流行于世界各地，在我国猪群中流行较为严重，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪细小病毒等混合感染，继发感染，给养猪业造成了巨大的损失。目前，疫苗接种是防控PCV2的有效手段，国内外研发的商品化PCV2疫苗已陆续获得上市认可，主要包括全病毒灭活疫苗、重组病毒嵌合灭活疫苗和重组亚单位疫苗，这些疫苗的应用为PCV2感染的控制发挥了重要的作用，但免疫效果仍有待进一步提高亚单位疫苗研究较多的是基因工程疫苗亚单位疫苗，是指含有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息。因此，亚单位疫苗不含有感染性组分，无须灭活，也无致病性。国内外许多学者将PCV2Cap蛋白单独表达以研制能有效防治PCV2感染的亚单位疫苗。常用的是病毒的杆状表达系统在昆虫细胞中表达的Cap蛋白，应用该系统获得的Cap蛋白能自我组装成类病毒粒子，将其免疫动物后可诱导高水平的ELISA抗体以及PCV2特异性的淋巴细胞增殖反应。如Boehringer-Ingelhein动物保健公司研制的PCV2疫苗CircoFLEX和Intervet动物保健公司研制的PCV2疫苗Circumvent，均是运用昆虫杆状病毒表达PCV2的0RF2基因，大量获得具有免疫原性的PCV2Cap蛋白，加入佐剂制备成疫苗。大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护，能减轻病毒血症，减少淋巴结组织损伤及PCV2病毒载量，对欧洲及北美的PCV2的控制发挥了巨大作用。目前我国也已有PCV2亚单位疫苗注册上市青岛易帮易圆净），适当降低了PCV2疫苗的防治费用，促进了生猪养殖业的发展。[0003]研究表明在PCV2Cap蛋白的N端或C端展示T细胞或B细胞表位，能提高特异性的免疫应答。鞭毛素Flagellin是细菌鞭毛丝状体的主要结构蛋白。作为一类独特的细菌病原相关模式，flagellin具有激活Toll-likereceptor5TLR5和NLPfamilyCARDdomaincontaining4NLRC4两条信号通路的免疫活性。大量研究表明，flagellin能以TLR5和NLRC4通路依赖的方式有效激活免疫应答，可以作为免疫佐剂有效增强疫苗抗原特异性的免疫应答;最近的研究表明Flagellin的第85至111位短肽能作为佐剂增强抗原特异性的免疫应答。[0004]发明内容：本发明的目的是公开一种可提高PCV2VLPS疫苗免疫效果的小分子佐剂TFlg13TFlg通过与PCV2Cap蛋白C端融合展示于PCV2VLPs表面，并通过激活TLR5通路来提高PCV2VLPs疫苗的免疫效果。[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种提高PCV2VLPs疫苗免疫应答的方法，其特征在于，通过在Cap蛋白C端展示TFlg提高PCV2VLPs疫苗免疫应答。[0006]—种Cap蛋白，其特征在于，编码所述Cap蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.1。[0007]—种Cap-TFlg蛋白，其特征在于，编码所述Cap-TFlg蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo·3〇[0008]一种制备Cap-TFlg蛋白的方法，其特征在于，其是将核苷酸序列为SEQIDNo.3转化进大肠杆菌进行原核表达制备得到。[0009]—种制备Cap-TFlg蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，Cap-TFlg基因人工合成，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，5’端带有Nco頂每切位点，3’端带有HindIΠ酶切位点；步骤二：以ρΕΤ-28α载体为骨架，使用NcoI和HindIII酶切并回收骨架片段，Cap-TFlg片段使用NcoI和HindIII酶切并回收，然后通过连接酶于16°C连接过夜，将连接产物转化入EZlO大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于IOyL培养基中用于菌落PCR鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pBac_Cap3;步骤三，将预表达鉴定为阳性的菌种转接于200mlLB加抗生素如kana抗生素，则终浓度50ugml的容量为IOOOml的大锥形瓶中培养，转接比例是1:100，培养条件：37°C，200rpmmin培养3〜4小时；步骤四：当㈤600值达到0.4〜0.6时，加乳糖至终浓度1%，开始诱导表达，诱导表达的条件:37°C，160rpmmin培养6小时；步骤五:用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4°C离心10分钟，弃上清；步骤六:加50ml缓冲液于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.9;步骤七:将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌，破菌条件:功率850w;破菌2分钟；步骤八:将破菌好的菌体离心，8000rpm，4°C离心15分钟，分离上清和沉淀；步骤九：将沉淀物用50ml缓冲液重悬于50ml离心管中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.4;步骤十:分别取40yL上清和40yL重悬的沉淀，加IOyL5X蛋白上样缓冲液，100°C加热10分钟，取IOyL煮好的样品进行SDS-PAGE电泳检测，即得到所述的Cap-TFlg蛋白。[0010]Cap-TFlg蛋白在制备PCV2疫苗中的应用，所述疫苗能够使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。[0011]—种PCV2VLPS疫苗，其特征在于，所述疫苗包含Cap-TFlg蛋白和佐剂。[0012]一种PCV2VLPS疫苗的制备方法，其是将Cap-TFlg蛋白与ISA206佐剂按照质量比1:1进行配苗制备得到。[0013]本发明利用生物信息学手段，通过自主设计，对猪圆环病毒2型的0RF2和flagellinTFlg基因进行原核密码子优化，并人工合成适合在大肠杆菌高效表达的Cap和Cap-TFlg蛋白表达基因。用本发明的Cap和Cap-TFlgVLPs与适当的佐剂混合分别免疫仔猪，Cap-TFlgVLPs能显著增强小猪的免疫应答，具有更好的免疫原性和保护性。[0014]附图说明：图1为重组的pET-28a-Cap和pET-28a-Cap-TFlg表达质粒图谱。[0015]图2为pET-28a-Cap603bp和pET-28a-Cap-TFlg684bp的验证结果，通道1:TakaraDNAMaker;通道2:阳性对照;通道3:阴性对照;通道4-6:pET-28a-Cap目的片段;通道4-8:pET-28a-Cap-TFlg目的片段。[0016]图3为pET-28a-Cap和pET-28a-Cap-TFlg的可溶性表达结果，通道l:TakaraproteinMaker;通道2:pET-28a_Cap-TFlg上清；通道3:pET-28a_Cap-TFlg沉淀；通道4:pET_28a_Cap上清;通道5:pET_28a_Cap沉淀。[0017]图4为pET-28a_Cap和pET-28a-Cap_TFlg蛋白电镜观察结果。[0018]具体实施方式：实施例1:一种表达Cap和Cap-TFlg蛋白的载体构建步骤l:Cap和Cap-TFlg基因人工合成，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示，5’端带有Nco頂每切位点，3’端带有HindIΠ酶切位点。[0019]步骤2:以ρΕΤ-28α本实验室保存载体为骨架，使用NcoI和HindIII酶切并回收骨架片段，Cap-TFlg片段使用NcoI和HindIII酶切并回收，然后通过连接酶于16°C连接过夜，将连接产物转化入£.coiiEZlOstrain大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于IOyL培养基中用于菌落PCR鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pBac_Cap3〇[0020]其中PCR鉴定采用ρΕΤ-28α载体引物，其PCR体系如下：成分体积Τ5TaqMix擎科生物）5μ1菌液ΙμΐpET_28a_F0.2ylpET_28a-R0.2ylCldH2O3·6μ1total10μ1〇[0021]PCR反应条件如下：98°C3min98°CIOs56°CIOs30cycles72°CIOs72°C30s16°C保存扩增产物经1%琼脂糖电泳鉴定分析，结果如图2,表明扩增出680bp左右的条带，大小与预期的一致，表明片段已经插入到载体当中。[0022]测序，将PCR鉴定与酶切鉴定均正确的质粒送出测序，测序结果显示与电子模拟图谱完全一致。[0023]实施例2:Cap和Cap-TFlg蛋白的可溶性表达步骤1:将预表达鉴定后的菌种转接于200mlLB加抗生素（如kana抗生素，则终浓度50ugml的大锥形瓶（容量1000ml中培养。转接比例一般是1:100。培养条件：37°C，200rpmmin培养3〜4小时。[0024]步骤2:当0D600值达到0.4〜0.6时，加乳糖终浓度1%，开始诱导表达。诱导表达的条件:37°C，160rpmmin培养6小时。[0025]步骤3:用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4°C离心10分钟，弃上清。湘仪离心机型号:GL-21M步骤4:加50ml缓冲液（20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.9于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中。[0026]步骤5:将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌。破菌条件：功率，850w;破菌2分钟。均质机，ATSEngineeringLimited，仪器型号:AH-1500。[0027]步骤6:将破菌好的菌体离心，8000rpm，4°C离心15分钟，分离上清和沉淀，湘仪离心机型号:GL-21M。[0028]步骤7:将沉淀物用50ml缓冲液20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.4重悬于50ml离心管中。[0029]步骤8:分别取40ul上清和40ul重悬的沉淀，加IOul5x蛋白上样缓冲液，100°C加热10分钟。取10U1煮好的样品进行SDS-PAGE电泳检测。[0030]实施例3:Cap和Cap-TFlg蛋白VLPs电镜观察样品制备铜网经过10〜30s的等离子清洗，碳面朝上;将一块封口膜铺在冰盒上冷却;将铜网放在冰的封口膜上;封口膜上分别滴样品、超纯水、PTA染液各20μΐ;放置1-2分钟，将铜网、样品、超纯水、PTA冷却;将铜网碳面扣在样品液滴上吸附样品1分钟，用滤纸与铜网垂直接触吸掉多余液体，直至看不到残留液体，持续吸水IOs;将铜网碳面扣在PTA液滴上染色0.5-〜1分钟，用滤纸吸干;放置在滤纸上，在阴凉处自然干燥，即可用于电镜观察。[0031]实施例4:不同疫苗免疫仔猪的抗体消涨规律步骤1:将Cap和Cap-TFlg蛋白的破菌上清经中饱和硫酸铵沉淀纯化后，分别与ISA206佐剂按照质量比1:1进行配苗。[0032]步骤2:筛选圆环抗体阴性、圆环抗原和蓝耳抗原阴性14〜21日龄仔猪25头，随机分为5组，每组5头。其中3组分别免疫Cap、Cap-TFlg和国内商品化疫苗2ml哈尔滨维科生物技术开发公司，猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株），兽药生字（2010080011071，1组免疫Cap-TFlg蛋白疫苗lml，剩余1组作为空白对照组，分别与免疫后14日、28日、60日、90日、120日、150日、180日采血，用商品化圆环抗体Elisa试剂盒进行抗体检测。[0033]表1不同圆环疫苗免疫仔猪抗体检测结果注：表示抗体检测结果为阴性，以OD值为阳性的血清最大稀释倍数的抗体效价从实验结果可以看出，Cap蛋白2ml组、Cap-TFlg蛋白Iml组和商品化圆环疫苗组免疫效果无明显差异，Cap-TFlg蛋白2ml组抗体产生时间更早，持续时间更长。[0034]实施例5:Cap_TFlg蛋白疫苗对初生仔猪的攻毒保护试验步骤1:筛选圆环抗体阴性、圆环抗原和蓝耳抗原阴性怀孕母猪4头，其中1头在产前42天免疫Cap-TFlg蛋白疫苗2ml，1头在产前42天免疫国内商品化疫苗2ml哈尔滨维科生物技术开发公司，猪圆环病毒2型灭活疫苗LG株），兽药生字（2010080011071，另外两头不做免疫。[0035]步骤2:待母猪生产14〜21日后，每窝随机挑选5头仔猪进行试验，免疫母猪生产仔猪作为免疫组，另外两组分别设为攻毒对照组和空白对照组。[0036]步骤3:对免疫组和攻毒对照组仔猪，在两腋下及两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLHICFA，0.5mgml4ml头，并经腹腔注射巯基乙酸培养基，IOml头。3日后，使用PCV2强毒病毒含量彡l〇UTCID5Qml滴鼻I.Oml头和肌肉注射2.Oml头，连续观察25日。对所有猪进行扑杀、剖检，符合以下3项判为发病：A体温特征:仔猪体温升高（彡40.5°C持续3日以上。[0037]B体重标准:相对增重率下降应不低于5%。[0038]相对增重率%=空白对照组仔猪平均日增重-攻毒对照组仔猪平均日增重）攻毒对照组仔猪平均日增重。[0039]C病毒抗原检测：用免疫组化方法检测淋巴结组织，应PCV2抗原检测阳性。[0040]以上任意两项，即可判断为PCV2发病。[0041]表2各试验动物发病结果判定从结果可以看出，在产前42天前进行Cap-TFlg蛋白免疫，可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。从本次实验结果来看，相比国内商品化疫苗，本发明的Cap-TFlg蛋白疫苗能够提供更好的免疫保护。

权利要求：1.一种提高PCV2VLPs疫苗免疫应答的方法，其特征在于，通过在Cap蛋白C端展示TFlg提高PCV2VLPs疫苗免疫应答。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述Cap蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.1〇3.—种Cap-TFlg蛋白，其特征在于，编码所述Cap-TFlg蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo·3〇4.根据权利要求3所述的Cap-TFlg蛋白的制备方法，其特征在于，其是将核苷酸序列为SEQIDNo.3转化进大肠杆菌进行原核表达制备得到。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，Cap-TFlg基因人工合成，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，5’端带有NcoI酶切位点，3’端带有HindIΠ酶切位点；步骤二：以ρΕΤ-28α载体为骨架，使用NcoI和HindIII酶切并回收骨架片段，Cap-TFlg片段使用NcoI和HindIII酶切并回收，然后通过连接酶于16°C连接过夜，将连接产物转化入EZlO大肠杆菌感受态细胞中，最终挑取菌落溶于IOyL培养基中用于菌落PCR鉴定，将阳性重组子提质粒并酶切鉴定以及测序，最终获得转移载体pBac_Cap3;步骤三，将预表达鉴定为阳性的菌种转接于200mlLB加抗生素（如kana抗生素，则终浓度50ugml的容量为IOOOml的大锥形瓶中培养，转接比例是1:100，培养条件：37°C，200rpmmin培养3〜4小时；步骤四：当㈤600值达到0.4〜0.6时，加乳糖至终浓度1%，开始诱导表达，诱导表达的条件:37°C，160rpmmin培养6小时；步骤五:用200ml离心杯收集菌体，6000rpm，4°C离心10分钟，弃上清；步骤六:加50ml缓冲液于离心杯中，用5ml枪头反复吹打，使细胞均匀分散在缓冲液中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.9;步骤七:将重悬均匀的菌体进行匀质机破菌，破菌条件:功率850w;破菌2分钟；步骤八:将破菌好的菌体离心，8000rpm，4°C离心15分钟，分离上清和沉淀；步骤九：将沉淀物用50ml缓冲液重悬于50ml离心管中，所述缓冲液为20mmolLTrisHCl，0.5molLNaCl，pH7.4;步骤十：分别取40yL上清和40yL重悬的沉淀，加IOyL5X蛋白上样缓冲液，100°C加热10分钟，取IOyL煮好的样品进行SDS-PAGE电泳检测，即得到所述的Cap-TFlg蛋白。6.根据权利要求3所述的Cap-TFlg蛋白，其特征在于，所述蛋白用于制备PCV2疫苗，所述疫苗能够使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。

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