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一种利用高效液相色谱制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30标准品的方法 

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申请/专利权人:江苏亢钧生物科技有限公司

摘要:本发明旨涉及一种利用高效液相色谱制备眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品的方法,其特征在于,本发明采用反相高效液相色谱法,通过不断优化制备条件,最终以ZorbaxSB300‑C8色谱柱(9.4mm*250mm,5μm),流动相A为0.05%水溶液TFA,流动相B为0.05%TFA的乙腈溶液,先进行洗脱,测得眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30产物占粗样品蛋白含量的百分比,再对粗样品进行分离纯化,制备眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品,分离纯化洗脱梯度条件为0‑12min,线性A:B梯度比例98:2‑76:24;12‑160min,线性A:B梯度比例76:24‑60:40;160‑165min,线性A:B梯度比例60:40‑40:60;165‑170min,A:B梯度比例40:60。最终制得的眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品纯度达到95%,为眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30基因工程表达后续研究提供了基础。

主权项:1.一种利用高效液相色谱制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30标准品的方法,其特征在于所述制备步骤如下:S01:眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液的制备;S02:眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液的透析;S03:利用反相高效液相色谱对所述S02的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液进行洗脱,测得眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30产物占粗样品蛋白含量的百分比;具体洗脱色谱条件为:色谱柱为ZorbaxSB300-C8,9.4mm×250mm,粒径5μm;流速0.3mLmin;柱温条件为室温25℃;上样量4ml;洗脱液A为0.05%水溶液TFA,pH2.0;洗脱液B为含0.05%TFA的乙腈溶液;具体洗脱梯度为0-10min,20%洗脱液B;10-40min,50%洗脱液B;40-50min,20%洗脱液B;S04:利用反相高效液相色谱对眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30粗样品进行分离纯化,制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30标准品;具体分离纯化色谱条件为:色谱柱为ZorbaxSB300-C8,9.4mm×250mm,粒径5μm;流速0.3mLmin;柱温条件为室温25℃;上样量4ml;洗脱液A为0.05%水溶液TFA,pH2.0;洗脱液B为含0.05%TFA的乙腈溶液;具体洗脱梯度为0-12min,线性A:B梯度比例98:2-76:24;12-160min,线性A:B梯度比例76:24-60:40;160-165min,线性A:B梯度比例60:40-40:60;165-170min,A:B梯度比例40:60。

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