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申请/专利权人：广东省人民医院

摘要：本发明公开了一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用。本发明利用tBID在墨西哥钝口螈中建立条件型靶细胞肌肉卫星细胞的消融方法，即利用肌肉卫星细胞的特异性启动子Pax7驱动tBID特异表达，并构建相应的转基因动物，通过Cre‑loxP系统实现tBID的可诱导性，当给予他莫昔芬时可诱导相应转基因动物的肌肉卫星细胞死亡。为理解墨西哥钝口螈各种生理及病理过程中特定细胞的功能提供了强有力的工具，可用于消融各种不同类型的细胞。

主权项：1.一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1将SceI-Tol2-CAGGS：Cherry载体利用限制性内切酶NheI和BamHI进行酶切，得到酶切后的SceI-Tol2-CAGGS载体；然后以质粒pGEMT-Pax7bait-P2A-GAP43-Cherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2为模板，利用引物A3和引物A4进行扩增，获得Cherry-T2A片段；以墨西哥钝口螈组织中的RNA反转录得到的cDNA为模板，利用引物A1和引物A2进行扩增，得到tBID片段；再以tBID片段为模板，利用引物A5和引物A6进行扩增，得到tBIDforGibson片段；最后将Cherry-T2A片段和tBIDforGibson片段连接到酶切后的SceI-Tol2-CAGGS载体上，得到SceI-Tol2-CAGGS:Cherry-T2A-tBID质粒；其中，引物A1、A2、A3、A4、A5、A6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～6所示；2将步骤1中得到的SceI-Tol2-CAGGS:Cherry-T2A-tBID质粒和CAGGs:LP-EGFP-LP-Yap1S96AS352A-T2A-Cherry载体分别利用限制性内切酶XmalI和ClaI进行酶切，得到tBID片段XmaI-tBID-ClaI和XmalI-vector-ClaI载体，然后将tBID片段XmaI-tBID-ClaI连接到XmalI-vector-ClaI载体上，得到SceI-Tol2-CAGGS:loxp-EGFP-loxp-tBID质粒；3将步骤2中得到的SceI-Tol2-CAGGS:loxp-EGFP-loxp-tBID质粒和Tol2转座酶mRNA显微注射到Pax7:Pax7-ORFbΔ-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2墨西哥钝口螈受精卵中，得到双转基因动物受精卵；然后室温常规饲养，得到双转基因动物；4将步骤3中得到的双转基因动物受精卵或双转基因动物利用他莫昔芬进行药物诱导，得到所述诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型。

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