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申请/专利权人：江南大学

摘要：本发明公开了一种高产β‑榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法。首先，通过germacreneA合成酶的筛选和甲羟戊酸代谢途径的过表达实现β‑榄香烯和germacreneA的从头合成；然后，通过删除中心碳途径中的竞争途径确保了类异戊二烯途径中乙酰辅酶A、丙酮酸和甘油醛‑3‑磷酸的可用性；接着采用番茄红素颜色作为高通量筛选方法，通过易于出错的PCR诱变获得了优化的NSY305N。最后，在摇瓶中，通过关键途径酶、外排工程和翻译工程的最终构建的菌株β‑EL‑4产生了1161.09mgL的β‑榄香烯和852.36mgL的germacreneA，是目前报道的摇瓶水平的最高产量，在4‑L补料分批发酵中，β‑榄香烯和germacreneA的产量分别达到3.52gL和2.13gL。

主权项：1.一种高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：包括，将过表达外排泵的外膜蛋白tolC和内膜脂多糖msbA的质粒pET-EKMGGT、携带合成β-榄香烯和germacreneA的代谢途径的质粒pA-ESKKD与携带过表达大肠杆菌的基因ispA的质粒pRSF-IN*IA转入敲除菌ΔpoxBΔppsAΔptsGΔcrrΔadhEΔldhAΔzwf中表达得到重组菌，即为高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌；其中，所述过表达外排泵的外膜蛋白tolC和内膜脂多糖msbA的质粒pET-EKMGGT的序列如SEQIDNO：15所示；所述携带合成β-榄香烯和germacreneA的代谢途径的质粒pA-ESKKD序列如SEQIDNO：4所示；所述质粒pRSF-IN*IA的序列如SEQIDNO：14所示；所述敲除菌ΔpoxBΔppsAΔptsGΔcrrΔadhEΔldhAΔzwf为基于大肠杆菌BL21DE3）的基因敲除缺陷菌，依次敲除基因丙酮酸脱氢酶poxB、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶ppsA、葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶ptsG、磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性酶IIA组分crr、乙酰醛辅酶A脱氢酶adhE、D-乳酸脱氢酶ldhA和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf，即得到大肠杆菌缺陷菌ΔpoxBΔppsAΔptsGΔcrrΔadhEΔldhAΔzwf；其中，所述敲除的基因poxB的序列如SEQIDNO：5所示，基因ppsA的序列如SEQIDNO：6所示，基因ptsG的序列如SEQIDNO：7所示，基因crr的序列如SEQIDNO：8所示，基因adhE的序列如SEQIDNO：9所示，基因ldhA的序列如SEQIDNO：10所示，基因zwf的序列如SEQIDNO：11所示；其中，用于敲除基因的质粒为pCas9和pTarget。

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