申请/专利权人：云南农业大学

申请日：2020-12-29

公开（公告）日：2024-06-18

公开（公告）号：CN112553367B

主分类号：C12Q1/6895

分类号：C12Q1/6895;C12Q1/6851;G01N27/06;G01N21/31

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.18#授权;2021.04.13#实质审查的生效;2021.03.26#公开

摘要：本发明一种利用ALA6鉴定紫花苜蓿耐热性的方法，研究了不同胁迫高温30℃、35℃、40℃和胁迫时间0d、2d、4d对‘德钦’紫花苜蓿MedicagosativaL.‘Deqin’不同部位根、茎、叶中12个P4型ATP酶基因AminophospholipidATPase，ALA1～ALA12相对表达量的影响。结果表明：在35℃下胁迫0～4d，紫花苜蓿P4型ATP酶基因大部分表现为随胁迫时间的延长而持续上升。根和茎在35℃胁迫4d后、叶在30℃胁迫4d后，ALA6相对表达量最高，分别为408.50、51.50、17.66。通过隶属函数和聚类分析，ALA6耐热相关性最高；ALA2耐热相关性较高；ALA1、ALA4和ALA5耐热相关性较低；ALA3和ALA7～ALA12耐热性相关性最低。综合试验结果推测ALA6基因与紫花苜蓿的耐热性有关。

主权项：1.一种紫花苜蓿P4型ATP酶基因耐热相关性检测方法，其特征在于，其具体的试验方法包括如下步骤：步骤一、材料选择处理选择紫花苜蓿；将种子播于花盆中，基质为灭菌泥炭土，放置于光照培养箱内，浇霍格兰营养液；步骤二、高温胁迫方法将一定苗龄的紫花苜蓿进行不同空气高温和时间胁迫后，分别测定根、茎和叶12个P4型ATP酶基因：ALA1～ALA12的相对表达量；步骤三、相对电导率测定参照叶尚红的方法并稍加改良，分别称取根、茎和叶0.20g放入3支试管中，在试管中加入15mL蒸馏水，室温下放置30min，用电导率仪器测定电导率S1，然后试管置沸水浴中20min，冷却后电导率仪测定电导率S2和蒸馏水电导率S0，并计算相对电导率；相对电导率％＝S1－S0S2－S0×100％步骤四、MDA含量测定分别称取根、茎和叶0.20g放入研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨至匀浆，转移至20mL刻度试管中，用3mL蒸馏水分两次冲洗研钵倒入提取液；然后另取一支刻度试管，加入5mL蒸馏水作为空白对照；分别在提取液和空白对照中各加入0.50％硫代巴比妥酸溶液5mL，在沸水浴上加热15min，待取出试管冷却后记下液体体积；再把液体转入离心管中，离心机3000rpm离心10min，取上清液到1cm的比色皿中，测定在600nm、532nm和450nm波长下的光吸收值，并计算MDA含量；步骤六、根、茎和叶总RNA的提取和反转录按照Super总RNA提取试剂盒的方法，分别提取不同胁迫温度和时间处理后根、茎和叶的总RNA，并跑1％琼脂糖凝胶电泳；0.27g琼脂糖和27ml1×TAE，观察其RNA质量；两条RNA带明显，无弥散，说明RNA未发生明显降解，可进行下一步总RNA反转录，用RTMasterMixKit试剂盒反转录合成cDNA；步骤七、P4型ATP酶基因荧光引物设计和相对表达量测定以紫花苜蓿肌动蛋白为内参，根据NBCI中已登录的P4型ATP酶基因序列为参考，用Primerdesigningtool在线软件https:www.ncbi.nlm.nih.govtoolsprimer-blastindex.cgi？LINK_LOC＝BlastHome设计引物，在TSINGKE生物公司合成；用qPCRMasterMix2X试剂盒测定紫花苜蓿根、茎和叶中P4型ATP酶基因相对表达量；所用的仪器为QuantStudio5.0，反应体系为qPCRMasterMix,2x10uL,10uMPrimerF0.4uL,10uMPrimerR0.4uL,CXR100x＊0.2uL,TemplateDNA2uL,ddH2O7uL；反应程序为HoldStage50℃2min，95℃10min；PCRStage95℃5s，60℃15s，72℃34s；MeltCurveStage95℃15s，60℃1min，95℃15s；P4型ATP酶基因相对表达量的计算采用2—△△Ct法； 步骤八、数据处理与分析用Excel、SPSS17.0、DPS2006软件进行数据分析；计算隶属函数值。

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