申请/专利权人：苏州优卡新材料科技有限公司

申请日：2018-02-02

公开（公告）日：2024-06-18

公开（公告）号：CN108130325B

主分类号：C12N15/10

分类号：C12N15/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.18#授权;2018.07.03#实质审查的生效;2018.06.08#公开

摘要：本发明公开了一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μm的无机纤维制成。本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果，本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右，而相比某进口纯化柱提高4倍左右，进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。

主权项：1.一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于：所述纯化柱的滤芯选用平均直径1.2~1.8μm氧化铝纤维，或者平均直径0.5~0.8μm的硅酸铝纤维，或者平均直径1.2~1.8μm氧化铝纤维与平均直径1.1~1.2μm玻璃纤维的混合物，质量百分比含量氧化铝纤维20%，所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O365~99%，SiO21~35%，所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O330~55%，SiO260~35%，ZrO20~17%，所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维，D-玻璃纤维，E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。

全文数据：一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱技术领域[0001]本发明涉及一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱。背景技术[0002]核糖核酸纯化柱Spincolumn是目前公知的用于各种材料的RNA提取以及精制的核心装置。其具有操作简单、回收率高、性能稳定等特点，目前这种产品已经为国内外大多数实验室和公司使用。[0003]已知的纯化柱的滤芯主要采用硅胶膜、硅基质膜或者硝化纤维等有机材料作为核糖核酸的特异性吸附材料，这类材料对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA\RNA，同时去除其他杂质。[0004]众所周知，分子生物学研究中MicroRNAmiRNA是由内源基因编码、长度约21〜25nt的一类非编码单链RNA分子，其主要功能是参与动植物转录后的基因表达与调控。提取纯化RNA是一个基础性的工作，各种临床检测或者基础科研中都需要提取纯化RNA。在核酸样本中低丰度的核酸检测中，纯化效率高则低丰度的核酸能获得更多，便于下游检测”等以突出该纯化柱的优势。[0005]目前国内外提取纯化RNA的方法中较为常见的一种为Trizol法。以提取正常人体血清microRNA为例，其流程通常为先取一定量的血清样品，加入Trizol裂解液和氯仿，离心取上清液，把上清液与乙醇混一起，上纯化柱提取，最后采用无RNase水无RNA酶的水洗脱。[0006]由于不同滤芯材料的纯化柱对于RNA的提取效果是不同的，因此对于提取后的RNA含量的后续检测也是评定纯化柱对于核酸吸附效果的重要环节。通常情况下，如果纯化柱的提取效果好则提取的总RNA含量高，那么在其中miRNA含量相对也高。当然现有技术中主要采取qPCR检测法，即实时PCR检测法专门检测个别miRNA的含量，如果含量高，则对应的Ct值小，说明纯化柱的提取效果好提取物纯度高）；如果含量低，则对应的Ct值大，说明纯化柱提取效果差提取物纯度低），对于目前的纯化柱来说，在相同的提取方法及操作条件下，最后能通过Ct的大小判断核酸纯化柱，或者说核酸纯化柱的滤芯的提取吸附效果。当然，RNA要进行PCR检测，必须将RNA先转换为DNA，所以在PCR检测环节中，RNA提取之后需要通过逆转录反应将RNA转换为DNA后再进行PCR检测。[0007]根据我们了解的情况并通过长期实践，目前以有机材料作为滤芯的纯化柱在提取效果上miRNA含量的提升有限，提取含量低于预期。这主要归结为现有纯化柱中滤芯材料的性能，因此为了提取得到纯度更高，量更大的核糖核酸，必须寻找更好的纯化柱滤芯替代材料。发明内容[0008]本发明目的是：提供一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，提取效果更好。[0009]本发明的技术方案是:一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μπι的无机纤维制成。[0010]进一步的，本发明中所述无机纤维选用下述单一或几种物质的混合物:氧化铝纤维、硅酸铝纤维及玻璃纤维。[0011]更进一步的，本发明中所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维，D-玻璃纤维，E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。[0012]进一步的，本发明中所述氧化铝纤维的组分质量百分比含量为:Al2O365〜99%，SiO21〜35%。[0013]更进一步的，本发明中所述硅酸铝纤维的组分质量百分比含量为：Al2O330〜55%，Si0260〜35%，Zr〇2〇〜17%。[0014]更进一步的，本发明中所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为：SiO250〜67%。八12030〜16%，00+]\%00〜25%，1?200〜18%，2抑20〜21%，82030〜10%，其中1?20是指Na2〇和K2O中的一种。[00Ί5]进一步的，本发明中所述无机纤维密度为0.2〜lgcm3。[0016]更进一步的，本发明中所述无机纤维密度为0.3〜0.5gcm3。[0017]本发明的优点是：[0018]本发明提供的这种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其相比目前采用有机材料作为滤芯的纯化柱，内部滤芯对于核糖核酸具有更高的吸附效果。根据人体血清miRNA提取实验的qPCR检测实验结果，本发明的纯化效果相比国产纯化柱提高10倍左右，而相比某进口纯化柱提高4倍左右，进一步提升了已有核糖核酸纯化柱的纯化品质。附图说明[0019]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：[0020]图1为Hsa-miR-16的一组qPCR检测扩增曲线图（3个NO-I纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0021]图2为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图（3个N0-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0022]图3为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图（6个N0-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0023]图4为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图（6个N0-3纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较）；[0024]图5为Hsa-miR-16的另一组qPCR检测扩增曲线图（6个N0-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较）；[0025]图6为hsa-miR-122的一组qPCR检测扩增曲线图（3个NO-I纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0026]图7为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图（3个NO-I纯化柱中去除偏差最大的一个后与国产、进口纯化柱比较）；[0027]图8为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图（3个N0-2纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0028]图9为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图（6个N0-3纯化柱与国产、进口纯化柱比较）；[0029]图10为hsa-miR-122的另一组qPCR检测扩增曲线图（6个N0-3纯化柱中最好的三个与国产、进口纯化柱比较）。具体实施方式[0030]实施例1:纯化柱的编号NO-I，其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.8μπι的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为=Al2O372%，SiO228%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米、氧化铝纤维密度0.38gcm3。[0031]实施例2:纯化柱的编号N0-2,其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.8μπι的氧化铝纤维、平均直径1.2μπι的C玻璃纤维和平均直径1.2μπι的E玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20%，C玻璃纤维40%，E玻璃纤维40%。其中：[0032]氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al2〇372%，Si0228%;[0033]C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO260%，Al2〇36%，Ca0+Mg020%，Na2010%,B2O34%；[0034]E玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO252%，Al2〇316%，Ca0+Mg025%，K200.6%，B2O36.4%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，该滤芯材料密度0·38gcm3〇[0035]实施例3:纯化柱的编号N0-3,其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径〇.5μηι的娃酸错纤维，其组分质量百分比含量为:Al2〇346%，Si〇254%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度0.42gcm3。[0036]作为比较例：[0037]国产纯化柱:为目前市面上可以买到的硅胶膜滤芯纯化柱。[0038]该硅胶膜滤芯重量0.03克，厚度2毫米，其滤芯材料密度0.38gcm3。[0039]进口纯化柱:某欧洲公司的217004miRNeasyMiniKit，其中纯化柱滤芯材料为有机高分子树脂。该进口纯化柱使用滤芯重量0.03克，厚度2毫米，其滤芯材料密度0.38gcm3。[0040]下面通过将上述实施例的纯化柱样例与国产、进口纯化柱共同进行人体血清miRNA的提取，并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16，Hsa-miR-122两种miRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小，说明对应纯化柱得到的miRNA越多，则其纯化效率越高。[0041]1.纯化柱：NO-I.3个[0042]NO'-23个N0-3ίΓ个[0043]国产纯化柱3个进口纯化柱2个。[0044]2.RNA提取方法采用经典的Trizol法：[0045]取3ml血清样品，加入Trizo1裂解液裂解，再加入氯仿，离心后取上清，上清液中加入结合液，混匀后将混合液均匀加入17个纯化柱内（一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等提取RNA，之后用IOOul无RNase水洗脱得到样品。[0046]对17个纯化柱分别进行编号NO-II，N0-12，N0-13，N0-2I，N0-22，N0-23，NO-3I，NO-32，NO-33，NO-34，NO-35，NO-36，国产纯化柱（I，国产纯化柱2，国产纯化柱3，进口纯化柱I，进口纯化柱2。[0047]3.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应，之后用逆转录产物做qPCR检测。[0048]4.结果：[0049]而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表对获取的每一样品均检测记录两次Ct值）：[0052]从上述表格我们可以看出：NO-I和N0-2纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-I2，其获取的样品两次检测结果为25.21544和25.25136,略大于NO-I和N0-2系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。[0053]N0-3纯化柱中最好的三个是NO-3I，N0-32和N0-35。而偏差最大的一个是N0-33，其获取的样品两次检测结果为25.62504和25.68264，略大于N0-3系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。[0054]各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的Ct值见下表：[0057]从上述表格我们可以看出：NO-I纯化柱中，Ct值结果偏差最大的一个是NO-I2，其获取的样品两次检测结果为30.96686和30.98852，略大于NO-I系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于国产和进口纯化柱获取样品检测的Ct值。[0058]N0-3纯化柱中最好的三个是NO-3I，N0-3⑵和N0-3⑷。[0059]而qPCR检测hsa-miR-16的扩增曲线图如图1〜图5所示，而qPCR检测hsa-miR-122的扩增曲线图如图6〜图10所示。[0060]从图中我们可以看到，经本案实施例NO-I、N0-2和N0-3纯化柱提取得到的RNA中相应基因hsa-miR-16和hsa-miR-122逆转录产物的扩增曲线明显都优于国产和进口纯化柱。[0061]从上述表格和图中我们可以得出结论：[0062]采用本发明无机材料滤芯的如-1、勵-2、勵-3纯化柱提取得到的1^-1^1?-161的^值几乎无差异，且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值。同样NO-I、N0-2、N0-3纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异，且均小于国产纯化柱和进口纯化柱的提取样品Ct值，[0063]Ct值小，说明纯化柱对样品的提取效果好提取物量更大，纯度更高）。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于国产纯化柱和进口纯化柱。经过长期实验对比检测，本发明的纯化柱的纯化效果比国产纯化柱效果高10倍左右，比进口纯化柱的纯化效果高4倍左右。[0064]实施例4:纯化柱的编号N0-4,其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径1.2μπι的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为=Al2O397%，Si023%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，氧化铝纤维密度0.38gcm3。[0065]实施例5:纯化柱的编号N0-5,其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料是平均直径1.2μπΐ的氧化铝纤维、平均直径1.ΙμΐΉ的C玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维20%，C玻璃纤维80%。其中：[0066]氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al2〇397%，Si023%;[0067]C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO267%，Al2OdCaO+MgO20%，Na2O8%，B2O33%;每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，滤芯材料密度0.42gcm3。[0068]实施例6:纯化柱的编号N0-6,其结构参见现有技术，特殊设计点是滤芯材料选用平均直径〇.8μπι的硅酸铝纤维，其组分质量百分比含量为=Al2O335%，SiO250%，ZrO2i5%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量〇.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度〇.38gcm3。[0069]作为比较例：[0070]自制对比例1:纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料选用平均直径5μπι的氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为=Al2O372%，Si0228%。[0071]每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，氧化铝纤维密度0.38gcm3。[0072]自制对比例2:纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料是平均直径5μπι的氧化铝纤维和平均直径2.6μπι的C玻璃纤维的混合物，它们各自质量百分含量为氧化铝纤维50%，C玻璃纤维50%，其中：[0073]氧化铝纤维，其组分质量百分比含量为Al20372%，Si0228%;[0074]C玻璃纤维，其组分质量百分比含量为SiO260%，Al2〇36%，Ca0+Mg020%，Na2010%，B2〇34%;每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，滤芯材料密度0.38gcm3〇[0075]自制对比例3:纯化柱结构参见现有技术，滤芯材料选用平均直径3μπι的硅酸铝纤维，其组分质量百分比含量为=Al2O346%，Si0254%。每个实验用纯化柱使用滤芯纤维重量0.03克，厚度2毫米，硅酸铝纤维密度0.38gcm3。[0076]下面通过将上述实施例4〜6的纯化柱样例与三个自制对比例共同进行人体血清microRNA的提取，并且通过qPCR检测法检测总RNA中特定基因Hsa-miR-16，Hsa-miR-122两种microRNA的Ct值来评估纯化柱性能。对应纯化柱检测得到的Ct值越小，说明对应纯化柱得到的miRNA越多，则其纯化效率越高。[0077]5.纯化柱：N0-43个N0-53个NO-66个[0078]自制对比例12个自制对比例22个自制对比例32个。[0079]6.RNA提取方法采用经典的Trizol法：[0080]取3ml血清样品，加入Trizol裂解液裂解，再加入氯仿，离心后取上清，上清液中加入结合液，混匀后将混合液均匀加入18个纯化柱内（一定要保证每个纯化柱内加入的混合液均匀且量相等提取RNA，之后用IOOul无Rnase水洗脱得到样品。[0081]对18个纯化柱分别进行编号NO-4I，N0-42，N0-43，N0-5I，N0-52，N0-53，N0-6I，N0-62，N0-63，N0-6⑷，NO-65，N0-66，自制对比例II，自制对比例1⑵，自制对比例2⑴，自制对比例2⑵，自制对比例3⑴，自制对比例3⑵。[0082]7.从各纯化柱中取等体积RNA样品做hsa-miR-16和hsa-miR-122的逆转录反应，之后用逆转录产物做qPCR检测。[0083]8.结果：[0084]而各纯化柱提取后经qPCR检测的Hsa-miR-16的Ct值见下表对获取的每一样品均检测记录两次Ct值）：[0087]从上述表格我们可以看出：N0-4和N0-5纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是N0-42，其获取的样品两次检测结果为25.17644和25.23254，略大于勵-4和勵-5系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。[0088]N0-6纯化柱中最好的三个是NO-6I，N0-62和N0-65。而偏差最大的一个是NO-63，其获取的样品两次检测结果为25.52504和25.63234，略大于N0-6系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。[0089]各纯化柱提取后经PCR检测的hsa-miR-122的CT值见下表：[0092]从上述表格我们可以看出：N0-4、N0-5和N0-6纯化柱系中，Ct值结果偏差最大的一个是N0-63，其获取的样品两次检测结果为29.98688和29.96645，略大于系中其他纯化柱获取样品检测的Ct值，但仍旧小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。[0093]从上述表格我们可以得出结论：[0094]采用本发明无机材料滤芯的N0-4、N0-5、N0-6纯化柱提取得到的hsa-miR-16d的Ct值几乎无差异，且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。同样NO-4、N0-5、N0-6纯化柱提取得到的hsa-miR-122的Ct值也几乎无差异，且均小于自制对比例的各化柱获取样品检测的Ct值。Ct值小，说明纯化柱对样品的提取效果好提取物量更大，纯度更高）。这表明本发明的纯化柱其对于miRNA的纯化效果大大优越于自制对比例（以平均直径2μπι的无机材料作为滤芯）的各化柱。[0095]当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于该纯化柱的滤芯采用平均直径小于2μπι的无机纤维制成。2.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述无机纤维选用下述单一或几种物质的混合物:氧化铝纤维、硅酸铝纤维及玻璃纤维。3.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述玻璃纤维是指C-玻璃纤维，D-玻璃纤维，E-玻璃纤维和AR玻璃纤维中的一种或几种的混合物。4.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述氧化错纤维的组分质量百分比含量为:AI2O365〜99%，Si〇21〜35%。5.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述娃酸错纤维的组分质量百分比含量为:Al2〇330〜55%，Si〇260〜35%，Zr〇2O〜17%。6.根据权利要求2所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述玻璃纤维的组分质量百分比含量为=SiO250〜67%Jl2O30〜16%，CaO+MgO0〜25%，1?2〇0〜18%，2抑2〇〜21%，82〇3〇〜10%，其中1?2〇是指恥2〇和12〇中的一种。7.根据权利要求1所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述无机纤维密度为〇.2〜lgcm3。8.根据权利要求7所述的一种核糖核酸提取用无机材料滤芯的高效纯化柱，其特征在于所述无机纤维密度为〇.3〜0.5gcm3。

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