申请/专利权人：成都云测医学生物技术有限公司

申请日：2024-04-11

公开（公告）日：2024-06-21

公开（公告）号：CN118028229B

主分类号：C12N5/0775

分类号：C12N5/0775

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.21#授权;2024.05.31#实质审查的生效;2024.05.14#公开

摘要：本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法。使用培养基A、培养基B培养iPSCs形成的细胞球分化获得神经球；使用水凝胶包裹神经球，然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养；将神经球从水凝胶中剥离，使用培养基C对神经球继续培养，获得神经类器官；消化神经类器官获得细胞，使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养；当细胞代次达到P2P3代时，再换用Yocon培养基进行继代培养获得标准的诱导间充质干细胞。本技术方案可以解决在无动物源性成分的条件下如何有效地将诱导多能干细胞分化形成诱导间充质干细胞的技术问题，具有理想的应用前景。

主权项：1.一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：S1：使用含有Y-27632的iPSC培养基培养诱导多能干细胞，获得细胞球；S2：先使用培养基A培养细胞球，然后将一半的培养基置换为培养基B继续培养，再将一半的培养基置换为培养基B继续培养，获得神经球；S3：使用水凝胶包裹神经球，然后使用培养基B对包裹后的神经球进行培养；水凝胶的原料为体积比3:2的VitroGelORGANOID-3和培养基B；或者为体积比3:2的VitroGelIKVAV和培养基B；或者为体积比3:6:7:4的IV型胶原、层粘连蛋白511、BiozellenA和培养基B；S4：将神经球从水凝胶中剥离，使用培养基C对神经球继续培养，获得神经类器官；S5：消化神经类器官获得贴壁细胞，使用ncMission培养基结合VTN包被对细胞进行原代培养；当细胞代次达到P2代或者P3代时，再换用Yocon间充质干细胞无血清培养基进行连续培养至细胞表面标志物检测合格，获得诱导间充质干细胞；其中，培养基A包括基础培养基和添加成分；基础培养基为DMEMF12；培养基A的添加成分包括：0.5-1.5％的非必需氨基酸、0.5-1.5％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、15-25％的KnockOut血清替代物、0.5-1.5μM的Dorsomorphin、0.5-1.5μM的A83-01；培养基B包括基础培养基和添加成分；基础培养基为DMEMF12；培养基B的添加成分包括：0.5-1.5％的非必需氨基酸、0.5-1.5％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、75-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5％的N2添加剂、0.5-1.5μM的SB-431542、0.5-1.5μM的CHIR-99021；培养基C包括基础培养基和添加成分；基础培养基为DMEMF12；培养基C的添加成分包括：0.5-1.5％的非必需氨基酸、0.5-1.5％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5-125μM的β-巯基乙醇、0.5-1.5％的N2添加剂、1.5-2.5％的不含维生素A的B27添加剂、2-3μgmL的胰岛素。

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