申请/专利权人：江南大学;浙江昂利康制药股份有限公司

申请日：2023-03-15

公开（公告）日：2024-06-21

公开（公告）号：CN116144518B

主分类号：C12N1/19

分类号：C12N1/19;C12N15/81;C12N15/31;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/61;C12P23/00;C12R1/865

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.21#授权;2023.06.09#实质审查的生效;2023.05.23#公开

摘要：本发明公开了一种生产视黄醇的酿酒酵母菌株及其应用，构建方法为：以酿酒酵母为出发菌株，引入外源基因crtE、crtB、crtI、crtYB、blh，在酵母细胞中构建视黄醇合成途径，通过多元模块化工程优化视黄醇的代谢网络，将视黄醇合成途径分为5个模块进行代谢调控，再通过转运体工程敲除转运蛋白Pdr5p，最后利用酶的半理性改造提高关键酶的催化效率，将突变后的脱氢酶基因ENV9与大肠杆菌来源的脱氢酶基因ybbo组合整合在酿酒酵母基因组中，视黄醇产量达到387.4mgL。最后优化培养基发酵条件，添加橄榄油作为萃取剂，摇瓶水平上视黄醇的产量达到1.2gL。

主权项：1.一种重组酿酒酵母，其特征在于：所述重组酿酒酵母异源表达GGPP合酶CrtE、八氢番茄红素合酶CrtB、八氢番茄红素去饱和酶CrtI、番茄红素环化酶CrtYB和β-胡萝卜素加氧酶Blh，过表达异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、法尼基焦磷酸合酶ERG20、乙醇脱氢酶ADH2、乙醛脱氢酶ALD6、乙酰辅酶A连接酶ACS1、GGPP合酶CrtE、八氢番茄红素去饱和酶CrtI、番茄红素环化酶CrtYB、β-胡萝卜素加氧酶Blh和NADH激酶POS5，弱化表达角鲨烯合成酶ERG9，敲除了柠檬酸合酶CIT2、苹果酸合酶MLS1、调节因子YPL062W和ABC转运体蛋白Pdr5p，将内源视黄醇脱氢酶ENV9第99位的苏氨酸突变为丙氨酸并引入异源视黄醇脱氢酶YBBO；所述内源视黄醇脱氢酶ENV9的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码GGPP合酶CrtE的基因如SEQIDNO.5所示，编码八氢番茄红素合酶CrtB的基因如SEQIDNO.6所示，编码八氢番茄红素去饱和酶CrtI的基因如SEQIDNO.7所示，编码番茄红素环化酶CrtYB的基因如SEQIDNO.8所示，编码视黄醇脱氢酶YBBO的基因如SEQIDNO.9所示，编码异戊烯基焦磷酸异构酶IDI的基因如SEQIDNO.10所示，编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因如SEQIDNO.11所示，编码法尼基焦磷酸合酶ERG20的基因如SEQIDNO.12所示，编码乙醇脱氢酶ADH2的基因如SEQIDNO.13所示，编码乙醛脱氢酶ALD6的基因如SEQIDNO.14所示，编码乙酰辅酶A连接酶ACS1的基因如SEQIDNO.15所示，编码β-胡萝卜素加氧酶Blh的基因如SEQIDNO.16所示，编码NADH激酶POS5的基因如SEQIDNO.17所示，编码柠檬酸合酶CIT2的基因如SEQIDNO.18所示，编码苹果酸合酶MLS1的基因如SEQIDNO.19所示，编码调节因子YPL062W的基因如SEQIDNO.20所示，编码ABC转运体蛋白Pdr5p的基因如SEQIDNO.21所示。

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