申请/专利权人：东北农业大学

申请日：2022-03-15

公开（公告）日：2024-06-21

公开（公告）号：CN114807312B

主分类号：C12Q1/6818

分类号：C12Q1/6818;C12Q1/689;G01N33/569;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.21#授权;2022.08.16#实质审查的生效;2022.07.29#公开

摘要：一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，属于食品安全技术领域。为了解决利用传统微生物学等检测致病菌方法中存在操作复杂，时间长和仪器设备昂贵等问题，实现大肠杆菌O157:H7现场可视化检测，本发明先用磁珠富集菌，再进行核酸外切酶Ⅲ循环扩增，扩增出的单链DNA含有G‑triplex序列，与氯化血红素结合后，可催化TMB和H2O2变成蓝色。本发明可以快速高效的捕获大肠杆菌O157:H7，不涉及核酸提取复杂繁琐的过程，具有操作简单，检测时间较短，成本低廉等优点。为实现快速检测大肠杆菌O157:H7提供了参考。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）复合物Apt-cDNA的制备：取相同体积的3.2μM大肠杆菌的适配体Apt和其互补短链cDNA相互混合，于90℃孵育5min，在3h内降至室温，形成终浓度为1.6μM的复合物Apt-cDNA；大肠杆菌适配体Apt的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其互补短链cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，大肠杆菌适配体Apt的5’端标记生物素；（2）适配体功能化磁珠的制备：取浓度为10mgmL的10μLM-270链霉亲和素磁珠SMBs于硅化管中，用50μL1×BW缓冲液洗涤三次，加入20μL2×BW缓冲液和20μL1.6μM的Apt-cDNA，置于200rpm摇床中37℃孵育1h，PBS缓冲液洗涤三次后，用PBS缓冲液重悬至20μL，4℃保存备用；（3）大肠杆菌O157:H7的检测：取1mL培养至108CFUmL-109CFUmL的菌液，用PBS缓冲液洗涤三次，离心后，用1mLPBS缓冲液重悬沉淀，稀释到106CFUmL-107CFUmL，取200μL菌液，加入步骤（2）获得的适配体功能化磁珠，37℃200rpm摇床孵育1h，磁分离后取上清液，加入浓度为100μM的2μLHP，40UExoIII孵育1h，孵育结束后加入8μL浓度为500mM的KCl溶液，在75℃条件下灭活ExoIII20min，并在1h内缓慢降至室温，以使切割剩余的序列形成稳定的G3结构，加入2μL浓度为100μM的氯化血红素，室温孵育30min后，再加入浓度为10mM的40μL的TMB和浓度为500mM的15μLH2O2反应20min，观察颜色呈深蓝色并使用酶标仪测定在650nm处的吸光值。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 东北农业大学 一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助扩增的可视化检测大肠杆菌O157:H7的方法

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