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申请/专利权人：华南农业大学
摘要：本发明公开了一种基于APEX2邻近标记技术探索前导链与后随链周围蛋白的方法，为选择DNA复制前导链和后随链相关的关键蛋白作为靶标构建含有EFIα启动子序列、APEX2以及V5的融合蛋白载体，再转化到宿主细胞系形成融合细胞系，通过生物素‑苯酚以及过氧化氢的处理，将邻近蛋白进行生物素标记，随后进行生物素化蛋白的提取和纯化，经过质量验证后，最后进行质谱与色谱的上机分析。本发明使用改进的APEX2邻近标记技术，克服了其他邻近技术，标记半径大，实验时间长的缺点，提高了效率。本发明改进的APEX2邻近标记技术更能适应该实验的需求，为DNA复制链周围蛋白的鉴定创造新的研究工具。
主权项：1.一种基于APEX2邻近标记技术探索前导链与后随链周围蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.构建APEX2融合蛋白表达载体：选择DNA复制前导链和后随链相关的关键蛋白作为靶标，将优化后的APEX2酶的编码序列融合到靶标蛋白的编码序列的N端或C端，将EFIα启动子序列、V5标签插入APEX2酶序列与靶标蛋白序列之间，连接到表达载体中，构建APEX2融合蛋白的表达载体；所述优化APEX2酶的编码序列如SEQIDNo.1所示；S2.APEX2融合蛋白的表达验证：将步骤S1构建得到的APEX2融合蛋白的表达载体转染宿主细胞，验证融合蛋白的表达和细胞内定位，根据目标蛋白以及V5标签的片段大小以判断目的蛋白是否成功表达；S3.APEX2催化活性的诱导：将步骤S2鉴定表达成功APEX2融合蛋白的目标细胞系通过生物素-苯酚以及过氧化氢的处理，对邻近蛋白进行生物素标记；S4.步骤S3生物素化蛋白的提取和纯化，进行质量验证；S5.对步骤S4质量验证合格的APEX2标记蛋白进行质谱色谱联用分析。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 华南农业大学 一种基于APEX2邻近标记技术探索前导链与后随链周围蛋白的方法
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