申请/专利权人：浙江省中医院、浙江中医药大学附属第一医院(浙江省东方医院);浙江省肿瘤医院

申请日：2023-10-18

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN118256440A

主分类号：C12N5/09

分类号：C12N5/09;C12N5/071;C12R1/91

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.06.28#公开

摘要：本发明公开了胃癌顺铂耐药细胞株及其建立方法。本发明基于不同细胞对顺铂的敏感性差异，针对不同细胞确定不同体系的培养参数，进行耐药细胞的筛选，在高效筛选的同时获得高度耐药的细胞；此外，还通过改进细胞耐药维护培养液的组成，大大提高了耐药细胞的增殖效率，可进一步提高筛选效率。利用本发明方法筛选得到的胃癌顺铂耐药细胞株HGC‑27DDP16和AGSDDP24具有高度耐药性。

主权项：1.一种胃癌顺铂耐药细胞株的建立方法，包括以下步骤：1第一次筛选：将含Na-1个胃癌细胞的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；待次日细胞贴壁后，吸弃原培养液，加入含浓度为Ca-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养；第3～5天换液时，换成含浓度为IC503-1的顺铂的细胞完全培养液进行培养，并在此浓度下连续培养14～21天；然后，更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养，所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-1的顺铂的细胞完全培养液，待细胞增殖至超过1×106个细胞后，得到第一次筛选耐药细胞株；2第二次筛选：将含Na-2个所述第一次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；待次日细胞贴壁后，吸弃原培养液，加入含浓度为Ca-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养；第3～5天换液时，换成含浓度为IC503-2的顺铂的细胞完全培养液进行培养，并在此浓度下连续培养14～21天；然后，更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养，所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-2的顺铂的细胞完全培养液，待细胞增殖至超过1×106个细胞后，得到第二次筛选耐药细胞株；……i第i次筛选：将含Na-i个第i-1次筛选耐药细胞株的细胞悬液转入有细胞完全培养液的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；待次日细胞贴壁后，吸弃原培养液，加入含浓度为Ca-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养；第3～5天换液时，换成含浓度为IC503-i的顺铂的细胞完全培养液进行培养，并在此浓度下连续培养14～21天；然后，更换至细胞耐药维护培养液中进行细胞耐药维护培养，所述细胞耐药维护培养液为含浓度为Cb-i的顺铂的细胞完全培养液，待细胞增殖至超过1×106个细胞后，得到第i次筛选耐药细胞株；其中，Na-i为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞实际数量，其为第i次耐药筛选中加入至培养瓶中的细胞数量理论值N-i的0.8～1.2倍；Ca-i为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂实际浓度，其为第i次耐药筛选中加入的含顺铂的细胞完全培养液中顺铂浓度理论值C1-i的0.8～1.2倍；Cb-i为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中顺铂实际浓度，其为第i次耐药筛选中细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i的0.5～1.5倍；每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2通过以下方式预先获得：①每次耐药筛选前，在三个不同时间点分别检测在含有不同浓度的顺铂的细胞完全培养液中细胞生长情况，并基于此计算得到在第一次、第二次和第三次的时间点检测得到的IC50和IC10，分别记为：IC501、IC502、IC503、IC101、IC102和IC103；相邻两次检测的时间间隔不应低于24小时；②通过以下公式Ⅰ～Ⅲ计算得到每次耐药筛选中各理论值N、C1、C2： 其中，Sa代表本次筛选所用的培养瓶的底面积；s代表步骤①中检测时单个培养孔的底面积；n代表步骤①中检测时初始铺板细胞数；R0为本次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i与前一次筛选所用的细胞耐药维护培养液中最佳顺铂浓度理论值C2-i-1的比值，即，R0-i＝C2-iC2-i-1，且R0-1设定为1。

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