申请/专利权人：南宁壮博生物科技有限公司

申请日：2022-04-24

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN114686572B

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12Q1/70

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2022.07.19#实质审查的生效;2022.07.01#公开

摘要：本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度；S2：基于所述试剂灵敏度和所述试剂稳定度获得对应的合格性测定结果。该发明基于对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂灵敏度和稳定度的检测，实现对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性的检测，保证了实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的有效性。

主权项：1.一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，其特征在于：包括：S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度；S2：基于所述试剂灵敏度和所述试剂稳定度获得对应的合格性测定结果；其中，S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：基于预设浓度梯度稀释所述实时荧光核酸恒温扩增检测试剂，获得多个同容量的待检测试剂；设定第一实验环境，在所述第一实验环境中将所述待检测试剂和所述病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第一实时荧光扩增曲线；确定出所述第一实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标值作为对应梯度浓度值对应的的第一反应时间；分析每条第一实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应浓度对应的第一荧光扩增变化率；确定出每条第一实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应浓度对应的第一稳定时间；将所有第一实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第一融合图像，基于预设方法确定出所述第一融合图像中的多个第一横坐标值，确定出所述第一横坐标值在所述第一融合图像中对应的多个第一样本点，获得每个第一横坐标值对应的第一样本点集合，基于所有第一横坐标值对应的第一样本点集合获得对应的第一样本点总集合；基于不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率和第一稳定时间以及所述第一样本点总集合，获得对应的第一测定结果；在所述第一实验环境中将预设量的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂和预设梯度拷贝模板值对应的病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第二实时荧光扩增曲线；确定出所述第二实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标作为对应拷贝模板值对应的第二反应时间；分析每条第二实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应拷贝模板值对应的第二荧光扩增变化率；确定出每条第二实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应拷贝模板值对应的第二稳定时间；将所有第二实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第二融合图像，基于预设方法确定出所述第二融合图像中的多个第二横坐标值，确定出所述第二横坐标值在所述第二融合图像中对应的多个第二样本点，获得每个第二横坐标值对应的第二样本点集合，基于所有第二横坐标值对应的第二样本点集合获得对应的第二样本点总集合；基于不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率和第二稳定时间以及所述第二样本点总集合，获得对应的第二测定结果；基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度；其中，基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：基于所述第一测定结果中不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率，计算出对应的第一灵敏度；基于所述第二测定结果中不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率，计算出对应的第二灵敏度；基于所述第一灵敏度和所述第二灵敏度计算出对应的试剂灵敏度；从所述第一测定结果中每个第一横坐标值对应的第一样本点集合中确定出所述第一横坐标值对应的第一离群点；确定出所述第一离群点对应的第一坐标值以及所有第一实时荧光扩增曲线中包含最多第一离群点对应的第一实时荧光扩增曲线中包含的第一离群点的第一总数和所述第一融合图像中包含的第一离群点的第二总数；基于所述第一离群点对应的第一坐标值、所述第一总数和所述第二总数以及所述第一稳定时间，计算出对应的第一稳定度；从所述第二测定结果中每个第二横坐标值对应的第二样本点集合中确定出所述第二横坐标值对应的第二离群点；确定出所述第二离群点对应的第二坐标值以及每条第二实时荧光扩增曲线中包含的第二离群点的第三总数以及所述第二融合图像中包含的第二离群点的第四总数；基于所述第二离群点对应的第二坐标值、所述第三总数和所述第四总数以及所述第二稳定时间，计算出对应的第二稳定度；基于所述第一稳定度和所述第二稳定度计算出对应的试剂稳定度；其中，预设浓度梯度稀释即为预先设置，根据实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的可用浓度范围设置的梯度变化的浓度值；其中，待检测试剂即为基于预设浓度梯度稀释实时荧光核酸恒温扩增检测试剂后获得的多个同容量的试剂；其中，第一实时荧光扩增曲线即为在第一实验环境中将待检测试剂和病毒样本分别进行混合后获得的对应的实时荧光扩增曲线；其中，第一反应时间即为第一实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标值；其中，第一阈值即为荧光反应结果可被肉眼识别时对应的最小实时荧光扩增值；其中，第一荧光扩增变化率即为每条第一实时荧光扩增曲线对应的实时变化率的平均值；其中，第一稳定时间即为每条第一实时荧光扩增曲线对应的极大值点对应的横坐标值；其中，第一融合图像即为将所有第一实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中后获得的图像；其中，预设方法为每隔10毫秒选取一个横坐标值；其中，第一横坐标值即为基于预设方法从第一融合图像中确定出的多个横坐标值；其中，第一样本点即为第一横坐标值在第一融合图像中每条第一实时荧光扩增曲线上对应的坐标点；其中，第一样本点集合即为第一横坐标值对应的所有第一样本点构成的集合；其中，第一样本点总集合即为第一融合图像中所有第一横坐标值对应的第一样本点集合构成的集合；其中，第一测定结果包括：不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率和第一稳定时间以及第一样本点总集合融合获得的结果；其中，预设梯度拷贝模板值即为预先设定的梯度变化的拷贝模板值，根据实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的可检测范围确定；其中，第二实时荧光扩增曲线即为在第一实验环境中将预设量的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂和预设梯度拷贝模板值对应的病毒样本分别进行混合后获得的对应的实时荧光扩增曲线；其中，第二反应时间即为第二实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第二阈值时对应的横坐标值；其中，第二荧光扩增变化率即为每条第二实时荧光扩增曲线对应的实时变化率的平均值；其中，第二稳定时间即为每条第二实时荧光扩增曲线对应的极大值点对应的横坐标值；其中，第二融合图像即为将所有第二实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中后获得的图像；其中，第二横坐标值即为基于预设方法从第二融合图像中确定出的多个横坐标值；其中，第二样本点即为第二横坐标值在第二融合图像中每条第二实时荧光扩增曲线上对应的坐标点；其中，第二样本点集合即为第二横坐标值对应的所有第二样本点构成的集合；其中，第二样本点总集合即为第二融合图像中所有第二横坐标值对应的第二样本点集合构成的集合；其中，第二测定结果包括：不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率和第二稳定时间以及第二样本点总集合；其中，基于所述第一测定结果中不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率，计算出对应的第一灵敏度，包括： 式中，α1为第一灵敏度，n为预设浓度梯度对应的总个数，i为第i个预设浓度梯度，t0ire为第i个预设浓度梯度对应的第一标准反应时间，t1ire为第i个预设浓度梯度对应的第一反应时间，ρ1i为第i个预设浓度梯度对应的第一标准荧光扩增变化率，ρ0i为第i个预设浓度梯度对应的第一荧光扩增变化率；其中，基于所述第二测定结果中不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率，计算出对应的第二灵敏度，包括： 式中，α2为第二灵敏度，m为预设浓度梯度对应的总个数，j为第j个拷贝模板值，t0jre为第j个拷贝模板值对应的第二标准反应时间，t2jre为第j个拷贝模板值对应的第二反应时间，ρ2j为第j个拷贝模板值对应的第二标准荧光扩增变化率，ρ0j为第j个拷贝模板值对应的第二荧光扩增变化率；其中，基于所述第一灵敏度和所述第二灵敏度计算出对应的试剂灵敏度，包括： 式中，α1为第一灵敏度，α2为第二灵敏度，α为试剂灵敏度；其中，基于所述第一离群点对应的第一坐标值、所述第一总数和所述第二总数以及所述第一稳定时间，计算出对应的第一稳定度，包括： 式中，β1为第一稳定度，q为第q个第一离群点，p为第二总数，χq为第q个第一离群点对应的第一坐标值中的横坐标值，χqs为与第q个第一离群点相邻的前一个坐标点的横坐标值，χqt为与第q个第一离群点相邻的后一个坐标点的横坐标值，yq为第q个第一离群点对应的第一坐标值中的纵坐标值，yqs与第q个第一离群点相邻的前一个坐标点的纵坐标值，yqt为与第q个第一离群点相邻的后一个坐标点的横坐标值，n为预设浓度梯度对应的总个数，i为第i个预设浓度梯度，tipe为第i个预设浓度梯度对应的第一稳定时间，t0ipe为第i个预设浓度梯度对应的第一标准稳定时间，b为第一总数；其中，基于所述第二离群点对应的第二坐标值、所述第三总数和所述第四总数以及所述第二稳定时间，计算出对应的第二稳定度，包括： 式中，β2为第二稳定度，u为第u个第一离群点，v为第四总数，χu为第u个第二离群点对应的第二坐标值中的横坐标值，χus为与第u个第二离群点相邻的前一个坐标点的横坐标值，χut为与第u个第一离群点相邻的后一个坐标点的横坐标值，yu为第u个第二离群点对应的第二坐标值中的纵坐标值，yus与第u个第二离群点相邻的前一个坐标点的纵坐标值，yut为与第u个第二离群点相邻的后一个坐标点的横坐标值，m为预设浓度梯度对应的总个数，j为第j个拷贝模板值，tjpe为第j个拷贝模板值对应的第二稳定时间，t0ipe为第j个拷贝模板值对应的第二标准稳定时间，a为第三总数；其中，基于所述第一稳定度和所述第二稳定度计算出对应的试剂稳定度，包括： 式中，β1为第一稳定度，β2为第二稳定度，β为试剂稳定度。

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