申请/专利权人：华中农业大学

申请日：2021-08-03

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN113832180B

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/60

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2022.01.11#实质审查的生效;2021.12.24#公开

摘要：本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种CRISPRCas13b介导的棉花RNA转录调控方法，对含有棉花内源启动子载体进行改造，以PbuCas13b蛋白取代原有的nCas9+Tad蛋白，构建在棉花中具有RNA编辑能力的载体CRISPRPbuCas13b；选取GhCLA和GhPGF为目标基因验证CRISPRPbuCas13b在棉花中的应用；设计靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将单碱基编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行qRT‑PCR，以jin668为对照，检测CRISPRPbuCas13b在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率。本发明的转化载体可在陆地棉基因组编辑中应用。

主权项：1.一种CRISPRCas13b介导的棉花RNA转录调控方法，其特征在于，所述CRISPRCas13b介导的棉花RNA转录调控方法包括以下步骤：步骤一，对含有棉花内源启动子pGhU6-7的7.10nCas9载体进行改造，以PbuCas13b蛋白取代原有的nCas9+Tad蛋白，构建在棉花中具有RNA编辑能力的载体CRISPRPbuCas13b；步骤二，选取GhCLA和GhPGF为目标基因验证CRISPRPbuCas13b在棉花中的应用；步骤三，设计2个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将单碱基编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行qRT-PCR，以jin668为对照，检测CRISPRPbuCas13b在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率；步骤一中，所述载体CRISPRPbuCas13b的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，CRISPRPbuCas13b载体的改造，包括：1基因合成：在NCBI上找到PbuCas13b的目的基因序列，前后加上SalI和MluI两个酶切位点，Amp抗性，克隆到pUC57载体；其中，目的序列PbuCas13b的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；2质粒提取：使用质粒小提中量试剂盒提取pUC57-PbuCas13b质粒；3酶切：酶切载体为pUC57-PbuCas13b和7.10nCas9；用SalI酶和MluI酶进行酶切；琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察，拍照保存；4T4连接酶切回收后的产物PbuCas13b和已酶切7.10nCas9载体，过夜；热击转化，挑取单克隆，阳检测序验证，得到适用于陆地棉的RNA编辑系统。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 华中农业大学 CRISPR/Cas13b介导的棉花RNA转录调控方法

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