申请/专利权人：新疆农垦科学院

申请日：2023-06-09

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN116463375B

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;C12N15/113;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/60

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2023.08.08#实质审查的生效;2023.07.21#公开

摘要：本发明公开了一种利用基因编辑技术创制棉花同时矮化和黄化材料的方法，属于农业生物技术领域。本发明公开的一种利用基因编辑技术创制棉花同时矮化和黄化材料，通过CRISPRCas9技术对棉花GhNAC3基因进行基因编辑，并进一步获得目的基因功能缺失的突变体材料，这些矮化和黄化材料具有重要的育种价值，也可作为遗传学研究的重要材料。

主权项：1.一种利用基因编辑技术创制棉花同时矮化和黄化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）针对基因GhNAC3的CDS序列，设计基于CRISPRCas9的2个sgRNA作用位点，分别命名为sgRNA1和sgRNA2，；所述sgRNA1和sgRNA2作用位点的核苷酸序列为：5’-CTGCAACGGAGTTACAGTTA-3’；SEQIDNO.3；和5’-GATCGAGTTCGGCGATAATA-3’；SEQIDNO.4；（2）gRNA+tRNA组合序列已经插入pGTR4载体，sgRNA1序列以接头方式加到反向引物上，从pGTR4质粒上扩增tRNA序列，获得第一个片段tRNA-sgRNA1；将sgRNA2序列以接头方式加到反向引物上，同样以pGTR4质粒为模板进行PCR，获得第二个片段gRNA-tRNA-sgRNA2，利用重叠PCR将两个片段拼成一个整片段gRNA-tRNA-sgRNA1-sgRNA2，pRGEB32-7s-F，GhNAC32s-F0，GhNAC32as-R0，GhNAC31as-R为引物，PCR扩增目的片段gRNA-tRNA-sgRNA1-sgRNA2；所述引物序列如下：pRGEB32-7s-F：5’-AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG-3’；SEQIDNO.5；GhNAC32s-F0：5’-CTGCAACGGAGTTACAGTTAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3’；SEQIDNO.6；GhNAC32as-R0：5’-TATTATCGCCGAACTCGATCTGCACCAGCCGGGAAT-3’；SEQIDNO.7；GhNAC31as-R：5’-TAACTGTAACTCCGTTGCAGTGCACCAGCCGGGAAT-3’；SEQIDNO.8；（3）将步骤（2）获得的目的片段gRNA-tRNA-sgRNA1-sgRNA2与载体pRGEB32-7-GhU6.9进行酶切连接，构建得到GhNAC3基因编辑载体pRGEB32-7--GhU6.9-GhNAC3；所述酶切连接反应体系如下：100ul体系，ddH2OUpto100ul，Buffer10ul，BSAⅠ4ul，pRGEB32-7-GhU6.910ug，37℃6h。（4）将步骤（3）获得的基因编辑载体pRGEB32-7-GhU6.9-GhNAC3转入农杆菌LBA4404，进行棉花遗传转化，经筛选鉴定获得棉花同时矮化和黄化突变体材料。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 新疆农垦科学院 一种利用基因编辑技术创制棉花同时矮化和黄化材料的方法

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