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申请/专利权人：云南省烟草农业科学研究院

摘要：本发明公开了一种改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法，包括病田寻访、布局诱发诊查、补接与诱发建立成熟病圃、病害调查评价抗性等4个步骤，本发明不需要先建立成熟病圃、再开展品种抗性鉴定，采用的病圃直接来源自然的零星发病田，在病田采用M垄2行纵横布局、均匀种植感病品种，作为病害指示植株，覆膜、滴灌造就了易于发病的温湿度条件，建立零星发病的病圃，再通过定向补接、补救接种均一化病圃，病圃经过或不经过条块状病圃、最终发展为成熟病圃，建立成熟病圃的同时完成品种的抗病性鉴定，缩短了建立成熟病圃2‑3年的时间，提高了烟草青枯病病圃抗性鉴定的时效性和规模化。

主权项：1.一种改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法，其特征在于：包括病田寻访、布局诱发诊查、补接与诱发建立成熟病圃、病害调查评价抗性4个步骤，具体包括：（A）病田寻访：明确往年植烟区烟草青枯病的发生与分布情况，选择交通便利的代表烟区，选取地势平坦、土壤质地和肥力均匀、排灌通畅、田块方正的发病地块作为病圃，并取土采用半选择性培养基分离病菌验证；（B）布局诱发诊查：布局，根据步骤（A）寻访获得病圃田块的大小、供试品种的多少设置3-4个重复，田块四周以及重复间相隔的纵垄种植感病对照品种，每重复横垄种植供试品种，每20-30个供试品种中设置1个感病对照品种，3-4个重复叠加在一起，纵垄与横垄均为M型、植烟2行、行距70-80cm、株距35-45cm；植烟后，覆盖黑色地膜增温、地插式滴灌维持土壤水饱和保湿方式诱发病害，每10天观察田间均匀分布的感病对照品种青枯病的发生情况，当发现局部有青枯病初期症状时，病圃具备发病的条件，为零星发病病圃；（C）补接与诱发建立成熟病圃：根据步骤（B）布局种植烟株功能根的伸展幅度，调节切根铲与烟株的距离和插切根际土壤的深度，沿垄两端创伤根系，顺切根点定株浇灌6.0-30.0×108cfumL的烟草青枯病菌悬浮液100-200mL补接1次，接种后，覆盖或不覆盖黑色地膜、地插式滴灌维持土壤水饱和保湿诱发病害，每10天观察、调查田间均匀分布的感病对照品种青枯病发生情况，直至田间均匀分布的感病对照品种由条块状发生青枯病到发病均匀、发病率80%以上或直接由零星发病到发病均匀、发病率80%以上，即病圃从零星发病的病圃经过或不经过条块状病圃最终发展为发病均匀、发病率80%的成熟病圃；（D）病害调查评价抗性：步骤（C）建立的病圃成熟时的当天或次日及其后每10天，按病害严重度调查记录病情，每次调查完成后计算病情指数，当感病对照品种的病情指数不低于60时停止调查，以时间间隔与病情指数计算病害曲线下面积AUDPC和病程相对抗性指数RRICD，基于不同抗性水平的参照品种数值范围划定抗性水平；所述步骤（A）的病田为单一病害的发病地块，即只发生烟草青枯病的田块、没有其他混发的根、茎基部病害；所述取土采用30-40m2分割、五点取样、每点取500g深度为20cm耕作层土壤、混匀作为1个土壤样品；所述半选择性培养基配方为蛋白胨10g、甘油5mL、酪蛋白水解氨基酸1g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL，半选择性培养基121℃灭菌20min后，待降到50℃后再添加100μgmL多粘菌素B、5μgmL结晶紫、50μgmL氯化三苯基四氮唑、25μgmL杆菌肽、0.5μgmL青霉素、5μgmL氯霉素和100μgmL放线菌酮；所述分离病菌采用土壤稀释涂平板法进行；所述步骤（C）烟株功能根为白色、未木栓化或未木质化的幼嫩侧根，具有吸收、分泌、输导、合成、繁殖多种生理功能；所述切根铲为直刀铲，宽5-8cm、长15-25cm，铲尖有刀锋、外缘齿状，铲上端带有可调节、固定的脚踩板，根据密集功能根的深浅进行调整、固定，铲柄末下段有10-25cm可调定位杆，根据烟株密集功能根根系生长的宽度以根茎部和铲柄为两端点调节距离、固定；所述烟草青枯病菌悬浮液采用分离、保存的青枯病菌在含有50μgmL氯化三苯基四氮唑的CPG培养基上28℃培养48h活化1-2次，挑取典型青枯单菌落用青枯病检测试纸条测定为阳性后，再在无氯化三苯基四氮唑的CPG培养基平板上高密度划线扩繁，将菌苔刮下，灭菌水调节青枯病菌浓度，青枯菌浓度以OD600快速计测、稀释涂布于无氯化三苯基四氮唑的CPG培养基平板上计数验证，浓度与剂量根据烟株的生长期确定，生长期越长，浓度与剂量越大；所述补接时仅接种无初期病害症状的烟株；所述发病率为发病株数占总株数的百分比；所述步骤（D）病害严重度，分级方法为：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧12以下叶片凋萎；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高12，或病侧12～23叶片凋萎；5级：茎部黑色条斑超过茎高12，但未到达茎顶部，或病侧23以上叶片凋萎；7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎；9级：病株基本枯死；病情指数（DI），采用如下公式计算： 其中，i：病情级数（0-9）；xi：i级植株株数；感病对照品种病情指数至少有1次调查时不低于60，烟草青枯病抗性鉴定有效，否则为无效所述步骤（D）病害曲线下面积AUDPC公式如下： 其中，yi为第i次记载的病情指数，包括初始病害调查，初始病害调查的病情指数为病圃成熟时当天或次日的调查结果，默认为第1次，往后顺延，yi+1为第i+1次记载的病情指数，ti+1－ti为第i+1次与第i次记载的间隔时间天（d）；病程相对抗性指数RRICD=100×（AUDPCCK—AUDPCT）AUDPCCK，式中AUDPCCK为感病对照品种病害曲线下面积，AUDPCT为供试品种病害曲线下面积；基于不同抗性水平参照品种数值范围划定抗性水平，分为5个等级：免疫（I）：RRICD100；抗（R）：RRICD30.1-99.9；中抗（MR）：RRICD20.1-30.0；中感（MS）：RRICD10.1-20.0；感（S）：RRICD10.0及以下，含负数;所述的CPG培养基组分为蛋白胨10g，葡萄糖10g，酪朊水解物1g，琼脂粉17g，水1000mL，pH为7.0。

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