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申请/专利权人：中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)

摘要：本发明公开EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备。该专利将FnCas12a蛋白，体外合成的crRNA和同源重组片段（含有P2A‑DHFR‑EYFP表达框的Et.Actin基因）利用Lonza4D‑Nucleofector核转仪导入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子，实现对鸡柔嫩艾美尔球虫的编辑。将编辑虫株经过鸡体内乙胺嘧啶筛选，获得高纯度的基因编辑虫株。然后，利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证，证明EYFP成功标记了Et.Actin基因。通过细胞培养该虫株的子孢子并感染鸡后，取盲肠粘膜并涂片显示该EYFP在基因编辑虫株的整个生活史中都有表达。此基因编辑方法能够对鸡球虫的基因进行定点标记，有助于解析球虫基因的功能。本专利对新型抗球虫药物和疫苗的研发也具有重要意义。

主权项：1.一种EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备方法，其特征在于该制备方法是利用FnCas12acrRNA对鸡柔嫩艾美尔球虫基因组进行编辑，利用FnCas12a表达质粒表达FnCas12a蛋白，体外合成Et.Actin基因的crRNA，构建含有P2A-DHFR-EYFP表达框的同源重组模板，将三者同时转染利用Lonza4D-Nucleofector转入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子，主要包括如下步骤：1FnCas12a蛋白的表达与纯化，FnCas12a的表达载体序列如SEQIDNO.1所示；2Et.Actin基因编辑位点crRNA的体外合成，Et.Actin基因的crRNA序列如SEQIDNO.2所示；3Et.Actin基因特异性编辑位点同源重组模板的构建，Et.Actin基因特异性编辑位点的同源重组模板序列如SEQIDNO.3所示；4EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建；5EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的验证，其中，步骤4中EYFP敲入Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的构建步骤为：将30μg的摩尔比1:1的FnCas12a：crRNA和40μg线性化的pActin-P2A-DHFR-EYFP同源重组模板利用Lonza4D-Nucleofector的100uL核转杯和转染程序EH100转入1×107的球虫子孢子；将转染子孢子通过泄殖腔接种给3日龄的雏鸡，经过乙胺嘧啶的3次筛选，获得高纯度的基因编辑虫株；步骤5EYFP敲入Et.Actin基因的柔嫩艾美尔球虫虫株的验证是利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证；所用的引物序列如SEQIDNO.4-9所示，并观察EYFP在基因编辑虫株整个生活史中的表达情况。

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