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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开一种plakoglobin基因敲入荧光斑马鱼的制备方法，包括：合成plakoglobingRNA；重组质粒hEMX1‑plakoglobinremainingCDS‑GGGS3‑EGFP的构建；hEMX1gRNA合成；将Cas9蛋白，plakoglobingRNA，hEMX1gRNA和重组质粒体系混合共同注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎中，通过鉴定、筛选和培养获得稳定遗传的plakoglobinEGFP‑KI荧光斑马鱼。本发明成功构建了斑马鱼plakoglobin基因特异表达增强型绿色荧光蛋白敲入实验模型，有利于直接观察和反映内源性plakoglobin时空表达模式和表达水平。

主权项：1.一种plakoglobin基因敲入荧光斑马鱼的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1合成plakoglobingRNA通过Ensembl获取斑马鱼plakoglobin基因序列号，在chopchop网站上分析第13个内含子序列，依据CRISPRCas9技术靶位点设计原则，设计靶位点合成上下游引物；以pMD19-gRNAscaffold质粒为模板，利用靶位点合成上下游引物进行PCR扩增，获得合成gRNA所需的双链DNA模板；DNA模板纯化回收后，体外转录及RNA纯化，即得gRNA；2重组质粒hEMX1-plakoglobinremainingCDS-GGGS3-EGFP的构建通过Ensembl获取斑马鱼plakoglobin基因全部序列，并设计引物用于补齐plakoglobin第13内含子以后的所有编码区DNA片段；将上述纯化片段利用同源重组方式连接进hEMX1-CDS-GGGS3-EGFP中，即成功构建重组质粒hEMX1-plakoglobinremainingCDS-GGGS3-EGFP；3hEMX1gRNA合成以pMD19-gRNAscaffold质粒为模板，进行PCR扩增，获得合成gRNA所需的双链DNA模板后体外转录，纯化，最终获得hEMX1gRNA；4将Cas9蛋白，plakoglobingRNA，hEMX1gRNA和重组质粒体系混合共同注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎中，通过鉴定、筛选和培养获得稳定遗传的plakoglobinEGFP-KI荧光斑马鱼。

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百度查询： 浙江大学 一种plakoglobin基因敲入荧光斑马鱼的制备方法及其对卵泡细胞的标记应用