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申请/专利权人：中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所)
摘要：本发明属于细胞生物学、生物化学和分子生物学等技术领域，公开了一种利用拟南芥细胞悬浮系制备完整叶绿体的方法。该方法首先利用酶解法进行悬浮细胞原生质体的制备，然后利用匀浆器进行原生质体的破碎后通过离心分离获得完整的叶绿体。与现有技术相比，本发明可以减少传统叶绿体提取过程中的限制条件，提高制备效率，同时发明利用拟南芥细胞悬浮系，可以延缓叶绿体成熟时间、捕捉发育早期的叶绿体，针对研究需求选择不同发育阶段的叶绿体进行制备，用于叶绿体相关机制研究。本发明具有重要的应用价值。
主权项：1.一种分离拟南芥原生质体的方法，其特征在于，包含以下步骤：1使用50ml离心管收集拟南芥7天光培养悬浮细胞25ml，以1000～1200rpm离心5～8min；共需250ml悬浮细胞分装至10个50ml离心管中；2去除上清，向沉淀中加入酶溶液至50ml刻度；每1000ml酶溶液的配方为：纤维素酶10g，离析酶2g，置于GM缓冲液中，室温下缓慢搅拌30分钟，滤纸过滤；3将其转移至大培养皿中；4在22℃下35rpm培养4-5小时，在此期间需频繁观察细胞壁裂解程度；5当观察到大多数细胞已裂解为原生质体后，小心转移至50ml离心管；后续操作需在预冷、绿光条件下使用装有水平转子的离心机完成离心工作；64800～5000g离心18～20min；7如有漂浮在表层的原生质体，与沉淀集中收集；在沉淀中加入GM缓冲液25ml，上下颠倒混匀；8将混合液1000rpm离心3～8min，以洗掉细胞碎片；9向沉淀中加入5mlS缓冲液，将混合物转移到15ml离心管中；其中，每200mlS缓冲液的配方为：MS培养基含维生素0.88g，蔗糖19.2g，使用KOH调节pH值为5.5；10800～1000rpm离心6～8min；11利用胶头玻璃吸管收集漂浮在表层的原生质体；步骤2和步骤7中，每1000mlGM缓冲液的配方为：MS培养基含维生素4.4g，葡萄糖30.5g，甘露醇30.5g，使用KOH调节pH值为5.5。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种利用拟南芥细胞悬浮系制备完整叶绿体的方法
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