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申请/专利权人：中国检验检疫科学研究院;天津科技大学

摘要：本发明公开了一种基于MIRA‑CRISPRCas12a的致病型克罗诺杆菌分型检测方法，分为对克罗诺杆菌基因组DNA的快速提取、MIRA恒温扩增靶基因、CRISPRCas12a系统分型检测三步，设计针对菌属和菌种的MIRA特异性引物以及相应的特异性CrRNA；若待测样品中存在克罗诺杆菌，靶基因经MIRA大量扩增后很快被针对靶基因的CrRNA识别，激活Cas12a酶非特异性切割报告探针达到检测目的，结果通过荧光信号或胶体金侧向流层析试纸条判读。本发明所构建的检测方法操作简单、快速便捷、灵敏度高、适用于现场检测；可在较短的时间内鉴别出待测样品中是否存在克罗诺杆菌污染，并分型判定致病菌种的类型，对有克罗诺杆菌引发的食品安全风险评估具有重要意义。

主权项：1.一种基于MIRA-CRISPRCas12a的致病型克罗诺杆菌分型检测方法，其特征在于：包括，从属的水平上鉴定待测样品中有无克罗诺杆菌；在属的鉴定结果为阳性的情况下，从种的水平上对致病型菌株分型检测，所述致病型菌株包括阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌；所述检测的方法包括，高温煮沸菌液、裂解菌体、释放核酸样品；特异性MIRA引物扩增样本中提取到的基因组DNA，得到扩增后的MIRA产物；设计并体外合成CrRNA序列；将扩增后的MIRA产物加入CRISPRCas12a荧光系统检测体系，采集每组酶切体系产生的荧光信号得到检测结果，同时，将CrRNA序列加入CRISPRCas12a系统中确定顺式切割可行性；其中，所述克罗诺杆菌属MIRA特异性引物序列为SEQNO.1、SEQNO.2，扩增片段大小为：528bp；所述阪崎克罗诺杆菌MIRA特异性引物序列为SEQNO.3、SEQNO.4，扩增片段大小为：460bp；所述丙二酸盐克罗诺杆菌MIRA特异性引物序列为SEQNO.5、SEQNO.6，扩增片段大小为：300bp；所述苏黎世克罗诺杆菌MIRA特异性引物序列为SEQNO.7、SEQNO.8，扩增片段大小为：248bp；所述克罗诺杆菌属的CrRNA核苷酸序列为SEQNO.9；所述阪崎克罗诺杆菌的CrRNA核苷酸序列为SEQNO.10；所述丙二酸盐克罗诺杆菌的CrRNA核苷酸序列为SEQNO.11；所述苏黎世克罗诺杆菌的CrRNA核苷酸序列为SEQNO.12。

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